Glive, sposobne razgradnje formaldehida: izolacija, karakterizacija in njihov metabolizem formaldehida.
Glive, sposobne razgradnje formaldehida: izolacija, karakterizacija in njihov metabolizem formaldehida
Headline text
Isolation and characterization of formaldehyde-degrading fungi and its formaldehyde metabolism http://dx.doi.org/10.1007/s11356-014-2543-2
UVOD
Formaldehid (HCHO) je humani karcinogen, ki povzroča nazofaringealni karcinom in verjetno tudi levkemijo. Kitajska pridela 1/3 vsega HCHO na svetu, tega pa večinoma tudi porabi, največ za izdelavo smol, ki se uporabijo na lesnih izdelkih. Odpadne vode iz pohištvenih tovarn so zato močno onesnažene s HCHO. Glede na citotoksičnost, ki jo HCHO povzroča, je njegovo odstranjevanje postalo nujno. Najbolj privlačna izmed možnosti se zdi bioremediacija z glivami, odpornimi na HCHO.
POJAV ODPORNOSTI
Ker je HCHO sam po sebi prisoten v naravi, so mikroorganizmi, kot npr. Pencillium sp., Aspergillus sp. in Trichoderma sp. nanj razvili odpornost. Ti HCHO najprej fiksirajo, nato pa ga oksidirajo do formata in CO2. Glive so zaradi boljše prilagoditve na ostrejše pogoje rasti bolj primerne za bioremediacijo, kot bakterije. Glive lahko uspevajo pri nižjem pH, nižji temperaturi, nižji koncentraciji N2, učinkoviteje izrabljajo vire O2. Poleg tega imajo glive preko hif večjo površino, ki je v stiku s kontaminantom, izolacija je manj zahtevna. Do sedaj je bioremediacija večinoma temeljila na bakterijah. Avtorji trdijo, da so za bioremediacijo primernejše glive, raziskati pa so želeli tudi metabolizem HCHO v odpornih sevih gliv.
IZOLACIJA IN KARAKTERZIACIJA ODPORNIH GLIV TER NJIHOV METABOLIZEM HCHO
Vzorec blata je bil odvzet v bližini tovarne s pohištvom v kitajskem Harbinu, provinci Heilongjiang. Koncentracijo HCHO v njem so izmerili spektrofotometrično (294,6±36,2 mg/ml). Alikvote vzorca so gojili v prisotnosti HCHO in dobljene kolonije izolirali. To so bile potencialne na HCHO odporne kolonije gliv. Prvi korak v identifikaciji je bilo morfološko vrednotenje pod mikroskopom, naslednji pa sekvenčna analiza regije ITS in gena za β-tubulin. ITS (angl. internal transcribed spacer) je regija ribosomalne DNA, ki jo v molekularni ekologiji gliv največkrat sekvenciramo. Genomsko DNA so izolirali iz micelijev odpornih kolonij. S PCR so pomnožili ITS in gen za β-tubulin, pomnoženim fragmentom določili nukleotidno zaporedje, nato pa so z orodjem BLAST po bazi podatkov GenBank iskali homologijo nukleotidnih zaporedij. Da bi raziskali metabolizem HCHO v odpornih sevih, so s pomočjo podatkovne baze KEGG izbrali 6 genov, ki so jih v prisotnosti HCHO pomnoževali s qRT-PCR in tako spremljali njihovo izražanje. Izbrani geni so bili za alkohol dehidrogenazo (ADH), aldehid dehidrogenazo (ALDH), od glutationa neodvisno HCHO dehidrogenazo (FADH), od glutationa odvisno HCHO dehidrogenazo (GDFADH) in S-formilglutation hidrolazo (FGH). Spektrofotometrično so merili tudi encimsko aktivnost teh encimov. Ob dodatku NAD+ (in glutationa) so pri povečani aktivnosti pričakovali porast absorbance pri 340 nm.
REZULTATI IN ZAKLJUČEK
Iz sedimenta so izolirali 2 seva nitastih gliv, sposobna razgradnje HCHO. Označili so ju kot Aspergillus nomius SGFA1 in Penicillium chrysogenum SGFA3. Sev SGFA1 je HCHO razgrajeval 3-krat bolj od seva SGFA2; SGFA1 je bil sposoben rasti pri 4000 mg/l HCHO, SGFA3 pa pri 900 mg/l. Nekaj raziskav o razgradnji HCHO z bakterijami, kvasovkami in nitastimi glivami je že bilo storjenih, doprinos tega članka pa je boljše razumevanje metabolne poti HCHO v nitastih glivah. Na primeru seva SGFA1 so s qRT-PCR ugotavljali ekspresijske vzorce genov, vključenih v metabolizem HCHO. Izmed 6 genov (za ADH, ALDH, FADH, GDFADH, FGH in FDH) se je ekspresija po tretiranju s HCHO opazno spremenila le pri 4 genih, v nadaljevanju pa so preučevali ekspresijo ALDH, GDFADH in FDH. Največjo spremembo v ekspresiji so opazili pri ALDH, ki pa so ga potem na podlagi substratne specifičnosti izključili; njegov substrat je acetaldehid. ALDH torej ni direktno vpleten v metabolizem HCHO; glive naj bi ščitil pred oksidativnim stresom. V drugih študijah je bilo ugotovljeno, da je glavni encim v metabolni poti HCHO GDFADH. GDFADH je med večino organizmov dobro ohranjen in katalizira od NAD+ in glutationa odvisni nastanek S-formilglutationa iz S-hidroksimetilglutationa. S-formilglutation se nato hidrolizira s pomočjo FGH v format in glutation. FDH nato oksidira format v CO2. V sevu SGFA1 sta specifični aktivnosti po tretiranju s HCHO občutno porastli v primerih GDFADH (7,34 U/mg) in FDH (2,58 U/mg). GDFADH in FDH so tako označili za ključna encima v metabolizmu HCHO pri nitastih glivah. Gre za katalizo, odvisno od prisotnosti NAD+ in glutationa (če teh dveh niso dodali v PCR mešanico, aktivnosti GDFADH in FDH niso mogli izmeriti). Aktivnost GDFADH in FDH so merili tudi pri sevu SGFA3, kjer pa aktivnosti po tretiranju s HCHO niso zaznali. Zaključili so, da metabolizem HCHO v SGFA3 ni odvisen od GDFADH in je kot tak različen od metabolizema pri SGFA1. Ker sta tako SGFA1 kot SGFA3 sposobna razgradnje HCHO, avtorji predlagajo mešano kulturo pri tretiranju odpadnih voda, kontaminiranih s HCHO.
