Identifikacija proizvajalcev antibakterijskih spojin z iskanjem odpornosti proti antibiotikom

V razvitem svetu se že dolgo ne bojimo nalezljivih bolezni. Na žalost pa se lahko to hitro spremeni, saj se zaradi evolucije mikroorganizmov razširja odpornost proti antibiotikom, še več, odkrivajo vedno več mikrobov, ki so odporni proti več antibiotikom hkrati. Problem je predvsem v tem, da se hitrost odkrivanja novih antibiotikov ne more kosati s hitrostjo naraščanja odpornosti.

Izzivi odkrivanja novih antibiotikov

Za uporabo novega zdravila morajo biti ta potrjena s strani raznih agencij, klinične študije antibiotikov pa so še posebej zahtevne. Placebo kontrole so v tem primeru neetične, kar je privedlo do tega, da klinične študije dokazujejo, da so nova zdravila slabša od obstoječih. Če hočejo to statistično ovreči, potrebujejo veliko ljudi, kar pomeni tudi velike stroške. Poleg stroškov pri kliničnih študijah so antibiotiki precej nedonosni, saj se jemljejo le kratek čas, medtem pa zdravila za kronične bolezni vseskozi prinašajo dobiček. Vse to odvrača farmacevtske družbe, da bi vlagale v to področje. Sintetične spojine so v manjšini antibiotikov, ki jih uporabljamo v klinične namene. Razlog, da sintetični antibiotiki pogosto niso uspešni je v tem, da so bakterijske celice razvile kompleksne in redundantne ovire za prodor v celice in zadrževanje teh spojin. Sintetične spojine so tudi prilagojene za delovanje v človeških celicah in ustrezajo pravilu Lipinskega, ki pa je sam poudaril, da pravilo ne velja za antibiotike.

Najpomembnejše antimikrobne razrede zdravil, med drugim β-laktame, tetracikline, makrolide, aminoglikozide, rifamicine in glikopeptide, proizvajajo aktinomicete. Aktinomicete so skupina mikroorganizmov, ki živi v prsti. To so gram pozitivne bakterije, ki tvorijo micele in so podobne glivam. Navkljub velikemu številu odkritih antibiotikov, ki jih proizvajajo aktinomicete, so farmacevti nad njimi večinoma obupali, saj prihaja do ponovnega odkrivanja že znanih spojin, presajanja pa dajejo zelo malo zadetkov. Za glikopeptidne antibiotike (GPA) so izračunali, da morajo pregledati 150 tisoč sevov aktinomicet za identifikacijo enega proizvajalca glikopeptidnega antibiotika.

V istem času, ko se farmacevti umikajo, pa so nedavno dostopna zaporedja genomov več bakterijskih in okoljskih metagenomov razkrili izjemno bogat potencial za proizvodnjo naravnih produktov. Še več, tehnike za genetsko modifikacijo teh organizmov in povezanih skupin biosinteznih genov postajajo vedno bolj sofisticirane ter ponujajo možnost razširitve kemijske raznolikosti z uporabo pristopov sintezne biologije. V članku Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance iz revije Nature Biotechnology Thaker in sod. poročajo o novem načinu odkrivanja proizvajalcev antibiotikov z uporabo rezistenčnega filtra.

Rezultati

Na podlagi, da imajo proizvajalci antibiotikov zaščitni mehanizem za preprečitev samomora, so se odločili, da je to primeren filter za identifikacijo proizvajalcev antibiotikov. Odpornost najpogosteje dosežejo z ohranjenim operonom vanHAX, ki modificira prekurzorje celične stene, da končajo z D-Ala-D-Lac namesto z D-Ala-D-Ala. Sposobnost prepoznavanja različnih GPA se razlikuje med proizvajalci in patogeni. Iz knjižnice aktinomicet so na gojišču z dodanim vankomicinom, ki je glikopeptidni antibiotik, izbrali odporne seve. Z uporabo značilnih biosinteznih genov GPA, ki jih imenujejo prstni odtisi proizvajalcev GPA, so postavili nezakoreninjeno filogenetsko drevo. Na podlagi zaporedja treh biosinteznih genov oxyB, oxyC in dpgC, so seve razporedili v tri veje. Dve izmed vej so bili proizvajalci vankomicinov in teikoplaninov, tretja pa bi lahko bili proizvajalci novega ogrodja. Eden izmed filogenetsko oddaljenih sevov, WAC1420, je ob optimiziranih pogojih proizvedel nov GPA. Okarakterizirali so ga z NMR, masno spektrometrijo in analizo kemijske degradacije. Poimenovali so ga pekiskomicin, po mestu, od koder prihaja zbirka aktinomicet. Pekiskomicin je neobičajen heptapetidni GPA z več edinstvenimi lastnosti in drugimi, ki jih deli s kanoničnimi GPA ogrodji. Peptid ima tri intramolekularne prečne povezave, podobne vankomicinu, kar ustreza odsotnosti oxyE (gena za monooksigenazo) v prstnem odtisu. Z razliko od vankomicina pa pekiskomicin nima N-metil-Leu na prvem mestu in asparagina na tretjem mestu, ampak ima tam N,N-dimetil-Ala in glutaminsko kislino. Tirozin na drugem mestu (namesto β-hidroksiTyr pri vankomicinu) in sulfatacijo deli s teikoplaninsko skupino molekul. Čeprav ima pekiskomicin skromno antibakterijsko aktivnost, ima nekaj učinka na enterokoke tipa B, ki so odporni proti vankomicinu.

Zaključek

Kanadski raziskovalci so pomembno izboljšali hitrost in frekvenco odkrivanja potencialnih proizvajalcev antibiotikov z uporabo dveh filtrov. Prvi filter temelji na podlagi odpornosti proti antibiotiku, drugi pa na prisotnosti prstnih odtisov biosinteznih genov za sintezo iskane vrste antibiotika. Filter za odpornost ni deloval pristransko samo za eno ogrodje, kar omogoča odkrivanje novih antibiotikov, pa tudi drugih naravnih produktov z raznolikimi farmacevtskimi aplikacijami. Filogenetska analiza prepreči ponovno odkrivanje znanih struktur in je zato nepogrešljiva pred nadaljnjimi analizami. Novo obdobje odkrivanja antibiotikov se torej začenja s sekvenciranjem genomov, bioinformatiko, napredno analizno kemijo in sintezno biologijo.

Viri

M. N. Thaker et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology 31, 922-927, 2013

G. D. Wright. Something old, something new: revisiting natural products in antibiotic drug discovery. Canadian Journal of Microbiology 60, 147–154, 2014