BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

BioWatcher je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.


Contents

Uvod

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi[1] in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe[2].


Načrt projekta

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov[3].

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles[4]. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. tobacco etch virus, TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. TEV cutting site), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični. Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah, v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo[5].


Rezultati eksperimenta

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

Delovanje receptorjev

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. GFP binding protein), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: BBa_K2635001.

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopen v registru BBa_K2635000

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry.

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije.

Reporterski sistem Lux

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encime za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem. Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma.

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence.

Biološka varnost

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. auxin-inducible degron), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah[6].

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].


Zaključek

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.


Viri

  1. Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. Computational and structural biotechnology journal. 2016;14:211–222.
  2. iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]
  3. Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annu Rev Biochem. (2013) 82:775–97.
  4. Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. Cell. 2013; 154:928–939.
  5. Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. PLoS ONE. 2014;9:1704
  6. Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nat. Methods. 2009;6:917–U978
Personal tools