Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search

UVOD

Sleeping Beauty (SB) je sintetični transpozonski sistem, ki je bil ustvarjen z namenom aktivacije prej utišanih evkariontskih transpozonov iz naddružine Tc1/mariner. Neaktivnost je bila posledica mutacij v regijah, ki so kodirale za encim transpozazo. Ime Sleeping Beauty izhaja iz dejstva, da so gen za transpozazo obudili iz dolgega evolucijskega spanca in rekonstruirali zaporedja, ki so jih našli v fosilnih ostankih različnih rib. Umetni SB transpozonski sistem je sestavjen iz transpozonskega plazmida, ki vsebuje izbrani gen, in transpozaznega plazmida, ki vsebuje zapis za encim transpozazo. Odpravili so določene pomanjkljivosti v domenah, ki so kodirale za transpozazo, in odstranili mutacije na različnih regijah, ki bi onemogočile uspešen transport encima iz citoplazme v jedro. Tako so leta 1997 ustvarili prvo Sleeping beauty transpozazo imenovano SB10, ki je uspešno sodelovala pri procesu transpozicije Tc1/mariner transpozonov.

MEHANIZEM SLEEPING BEAUTY TRANSPOZICIJE

Mehanizem Sleeping beauty (SB) transpozicije je sestavljen iz 4 delov: vezava Sleeping beauty transpozaze na DNA, nastanek sinaptičnega kompleksa, izrezovanje Sleeping beauty transpozona in integracija Sleeping beauty transpozona.

Vezava Sleeping beauty transpozaze na DNA

Transpozicija se začne z vezavo transpozaze na transpozonsko DNA. DNA vezavna domena transpozaze, ki je sestavljena iz dveh poddomen PAI in RED, je odgovorna za prepoznavanje DNA. PAI ima glavno vlogo pri bazno specifični vezavi na DNA. 3'-konec transpozaznega vezavnega mesta vsebuje osrednje zaporedje, ki je ohranjeno v vseh štirih kratkih direktnih ponovitvah (ang. short direct repeats, DR) prepoznanih s strani PAI poddomene. RED poddomena se povezuje s 5'-koncem zunanjih kratkih direktnih ponovitev, ki so sosednje osrednjemu zaporedju. Ta omogoča specifičnost procesa, tako da onemogoča vezavo transpozaz iz drugih podobnih družin na Sleeping beauty transpozon. Vsa štiri vezavna mesta za transpozazo znotraj končnih obrnjenih ponovitev (ang. terminal inverted repeats, TIR) so potrebna za Sleeping beauty transpozicijo. Za uspešno transpozicijo potrebujemo vsaj 300 bp dolg most med levimi in desnimi končnimi obrnjenimi ponovitvami. Kompleksna struktura končnih obrnjenih ponovitev pri SB transpozonu omogoča večjo pravilnost in natančnost procesa v primerjavi s transpozoni, ki imajo enostavno sestavljene TIR.

Nastanek sinaptičnega kompleksa

Naslednji korak je oblikovanje sinaptičnega kompleksa. Konca transpozona sta med seboj povezana s pomočjo transpozaznih podenot. Za oblikovanje so potrebne transpozaze, kompetentne za tetramerizacijo in celotne končne obrnjene ponovitve s štirimi vezavnimi mesti za transpozaze (to so kratke direktne ponovitve). Nastanek kompleksa se začne z vezavo PAI poddomene na levi notranji DR. Ko se doda še ena podenota SB transpozaze, nastane dimer. Vezava RED poddomene na notranji DR je omejena, zato se transpozazni dimeri na levem TIR tvorijo s pomočjo proteinskih povezav med RED-RED poddomenami. Dimer se nato poveže na notranji DR na sosednjem TIR. K nukleoproteinskemu kompleksu sta dodani še dve SB transpozazi, kar omogoči vezavo na zunanje DR in formacijo v sinaptični kompleks. Proces je končan, ko RED poddomene prepoznajo zunanje DR in s tem kompleks pripravijo na izrezovanje transpozona s katalitično domeno.

Izrezovanje Sleeping beauty transpozona

Formaciji sinaptičnega kompleksa sledi izrezovanje SB transpozona iz donorskega lokusa, ki se začne s hidrolizo fosfodiestrske vezi v skeletu DNA. Reakcija je odvisna od magnezijevega kationa, katalizirana pa je s pomočjo aminokislinskega zaporedja DDE na katalitični domeni transpozaze. Cepitev prve verige z nukleofilnim napadom vode povzroči nastanek zareze s prosto 3'-OH skupino. V naslednjem koraku se cepi komplementarna DNA veriga, kar vodi do sprostitve transpozona iz donorske DNA. Ugotovili so, da je za vse korake izrezovanja odgovoren zgolj en transpozazni dimer, pri čemer vsaka monomerna enota katalizira izrezovanje na eni strani transpozona. Izrezovanje je znotraj transpozicijskega elementa zamaknjeno in posledično nastanejo tri nukleotide dolgi štrleči konci na konicah izrezanih transpozonov in donorske DNA. Poleg elementov, ki se prenesejo na tarčno DNA, dobimo pa tudi krajše zaporedje oziroma transpozonski prstni odtis na donorski DNA.

Integracija Sleeping beauty transpozona

Prosti 3'-OH konci izrezanih transpozonov so ključni za integracijski korak. Imajo vlogo nukleofilov, ki napadajo fosfodiestrske vezi na tarčni DNA, da lahko poteče transesterifikacijska reakcija. To vodi do kovalentne sklopitve transpozonskih koncev s tarčno DNA. Mehanizem še ni popolnoma razjasnjen, glede na obnašanje podobnih transpozonskih sistemov pa sklepajo, da je tudi tukaj za uspešno integracijo potrebna ukrivitev tarčne DNA vijačnice za vsaj 140 stopinj. Le-ta povzroči izpostavitev fosfatnih regij za napad transpozonskih koncev. Integracija štrlečih koncev DNA povzroči nastanek enoverižnih vrzeli, ki so zapolnjene s pomočjo popravljalnih mehanizmov, kar vodi do podvojitve tarčnih mest, ki obkrožajo element. V večini primerov integracija pri SB transpoziciji poteče na TA dinukleotidnih mestih, gledano z genomskega vidika, pa se integracija pri SB transpozonih v veliki večini zgodi naključno.

BIOTEHNOLOŠKA UPORABA SB TRANSPOZONA

Vstavljanje SB transpozona

Transpozone lahko v organizem vstavimo s pomočjo plazmidov različnih vrst, kot na primer pFAR (to so plazmidi biološko varnih evkariotskih vektorjev, primernih za gensko terapijo) ali MC (ang. minicircle). Za uspešno transpozicijo pa moramo vstaviti tudi transpozazo. Oboje lahko vnesemo s pomočjo elektroporacije ali transfekcije. Sleeping beauty transpozaza je direktno dostopna, če uporabljamo rekombinantne proteine, ali pa se mora sintetizirati iz SB mRNA ali iz ekspresijske kasete. Na efektivnost transpozicije vpliva vrsta izbranega vektorja. Pri SB transpozonu morajo biti TIR zelo skupaj, da lahko poteče katalitični korak. Zaradi tega je veliko bolje uporabljati MC (to so krožni geni pridobljeni iz plazmida). Učinkovitost se poveča tudi, če transpozazo vstavimo v obliki mRNA (namesto v obliki kasete), poleg tega pa se poveča še biološka varnost uporabe (ni transkripcije), saj je transpozaza manj časa prisotna v celici. Pomembno je poudariti, da lahko, če presežemo optimalno koncentracijo potrebne transpozaze, ta inhibira transpozicijo. Razlog za to bi lahko bil v veliki občutljivosti transpozaze na pravilno zvijanje, saj ta ob visokih koncentracijah zaradi hitre sinteze ne more vedno poskrbeti za natačno zvijanje, kar pa inhibira transpozicijo.

Optimizacija metod uporabe SB

Za biotehnološke procese je optimizacija metode, ki se je poslužujemo, bistvenega pomena. V primeru metode SB je enega največjih odkritij pomenila sinteza transpozaze SB100X. Na podlagi razvozlane kristalne strukture encima SB10, so njegovo katalitično mesto spremenili tako, da se je njegova aktivnost povečala za 100-krat, od tod tudi izvira ime novi rekombinantni transpozazi. Vendar pa se iskanje možnosti izboljšave tega genskoinženirskega orodja še ni končalo. Leta 2019 so ustvarili visokotopno različico SB100X, ki je bila od navadne boljša v temperaturni stabilnosti in topnosti ter zaradi tega manj nagnjenja k agregaciji v celici, kar je bila velika ovira pri uporabi encima. Visokotopna SB100X se je v nizki meri zmožna sama prebiti (tj. brez uporabe npr. elektroporacije) v celico, vendar mehanizem te nenavadne transfekcije še ni docela poznan, a se ga poleg encima raziskuje, saj ima zaradi svoje narave biotehnološko perspektivne lastnosti, kot so cenovno ugodna in velika produkcija ter zmožnost dolgotrajnega shranjevanja. Kot že omenjeno, SB transpozone v genom vstavlja naključno. Učinkovita integracija na željena mesta genoma evkariontskih celic je z transpozonskimi metodami zahtevna. Orodje bakterijskega izvora CRISPER/Cas9 pa to naredi uspešno. Encim Cas9 vsebuje DNA vezavno domeno, ki s pomočjo vodilne RNA, usmeri restriktazo na mesto cepitve DNA vijačnice. Zato so se raziskovalci odločili, da ti dve orodji združijo. Vzeli so transpozazo SB100X in jo povezali s katalitično neaktivno restriktazo Cas9. Encimski kompleks je na mesta DNA, ki so bila kodirana na vodilni RNA, pogosteje deloval, a je potrebno še veliko izboljšav, saj je integracija potekla tudi na naključnih mestih genoma. Zanimiva je tudi različica transpozaze SB, ki izrezovanje transpozona izvede tako učinkovito kot SB1ooX, vendar ga nato ni zmožna integrirati. Tako obliko encima so raziskovalci naredili z uvedbo ene mutacije v aminokislinskem zaporedju. Uporablja se v reprogramiranju celičnih linij.

Primeri biotehnološke uporabe

Sleeping beauty transpozone lahko uporabljamo za izdelavo celičnih linij (npr. induciranih pluripotentnih matičnih celic sesalcev), gensko terapijo, gensko spreminjanje živali in raziskovanje raka. Natančneje bomo obravnavali slednji dve. Gensko spremenjene živali so nepogrešljive pri raziskovanju patofiziologije živalskega sveta. Transgene živali, ki ne/izražajo specifične proteine, nam omogočajo monitoring dinamičnih procesov in vpliv novih zdravil na organizem. Prašiči so zaradi svoje biološke podobnosti človeku večkrat uporabljeni za preučevanje raznih bolezni (kardiovaskularne, diabetes, rak), vendar so bile tradicionalne tehnike genskega spreminjanja zaradi kompleksnosti organizma neuspešne. Metoda SB pa je to zmožna. Raziskovalci so razvili enostopenjski postopek za vnos več genov v prašiča in kravo. To so nedvoumno potrdili s tem, da so v modelna organizma vstavili gen za fluorescenco in živali opazovali pod vzbujevalno svetlobo fluorescentnega proteina, ki se je izražal. Poleg učinkovitosti pa orodje SB v žival ne vstavi potencialno nevarnih delov DNA (zapis za antibiotično odpornost) kot pri tradicionalnih metodah. V prihodnosti bo imela uporaba tehnik na podlagi SB zagotovo vpliv na produkcijo transgenih živali, tako v raziskovalne namene kot na živinorejo. Metoda SB pa poleg bolj industrijskih aplikaciji obeta tudi na področju genomike, saj zaradi njene naključne integracije transpozonov omogoča nepristranski način raziskovanja genoma, ki na primer povzroči rakava obolenja. SB transpozoni opremljeni s kasetami, ki inducirajo pridobitev ali izgubo funkcije gena, se razpršijo po celotnem genomu in ustvarijo ogromen nabor fenotipov. Zanimivi so nato izbrani za nadaljnje raziskovanje. Nukleotidni zapis za fenotipske značilnosti je relativno enostavno najti, saj z uporabo sekveniranja poiščejo označevalce na transpozonih, ki so se vgradili. Metodo so prikrojili tako, da so transpozone opremili z mutagenimi dejavniki, nato pa spremljali njihov vpliv na razvoji celičnih linij. Na ta načini odkrivajo potek razvoja rakavih obolenj.

Prednosti in slabosti uporabe SB sistemov

Poglavitne prednosti uporabe SB transpozonskih sistemov so sposobnost naključnega vstavljanja, cenovno ugodna vektorska produkcija in dolgoročna obstojnost transpozaze. V primerjavi z retrotranspozoni pri SB sistemih ni potrebna inverzna transkripcija, zato lahko poteka izražanje genov z bolj kompleksno strukturo (ponavljajoči motivi, regulatorne sekvence itd.). Pri uporabi pa se pojavljajo tudi določene omejitve. Pri študijah sprememb v transkriptomu celičnih linij so ugotovili, da SB transpozoni lahko spremenijo nivo transkripcije, zato v takih primerih njihova uporaba ni najbolj primerna. Poleg tega tudi naključna distribucija po genomu s seboj prinaša določena tveganja. Raziskave in napredki na področju tarčnega usmerjanja vstavljanja transpozonov so zato še toliko bolj obetavni. Najnovejše študije kažejo na to, da bi do neke mere tarčno usmerjanje lahko potekalo tudi preko mutantnih različic 3 aminokislin (H187, P247 in K248), ki naj bi v večji meri preusmerjale integracijo na palindromska AT zaporedja, stran od eksonov in drugih regulatornih transkripsijskih elementov.

VIRI

‘Jumping Ahead with Sleeping Beauty: Mechanistic Insights into Cut-and-Paste Transposition - PMC’. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7827188/ (accessed Apr. 26, 2022).

M. Amberger and Z. Ivics, ‘Latest Advances for the Sleeping Beauty Transposon System: 23 Years of Insomnia but Prettier than Ever’, BioEssays, vol. 42, no. 11, p. 2000136, 2020, doi: 10.1002/bies.202000136.

Z. Ivics, P. B. Hackett, R. H. Plasterk, and Z. Izsvák, ‘Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells’, Cell, vol. 91, no. 4, pp. 501–510, Nov. 1997, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80436-5.

‘A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion | Nature Biotechnology’. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0291-z (accessed May 01, 2022).

S. A. Narayanavari, S. S. Chilkunda, Z. Ivics, and Z. Izsvák, ‘Sleeping Beauty transposition: from biology to applications’, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 52, no. 1, pp. 18–44, Jan. 2017, doi: 10.1080/10409238.2016.1237935.