Cepivo proizvajalca Pfizer / BioNTech - optimizacija zaporedja molekule mRNA

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Podjetji Pfizer in BioNTech sta se septembra 2020 odločili, da objavita celotno zaporedje molekule mRNA, ki jo vsebuje njihovo cepivo Comirnaty1 in nosi zapis za celoten protein bodice z optimizirano rabo kodnov2. Poleg optimizacije so v zaporedje namesto uridinov uvedli N(1)-metilpsevdouridin (m1Ѱ)1,2. Ta sprememba zmanjša aktivacijo prirojenega imunskega sistema zaradi prisotnosti tuje mRNA, ki jo sedaj težje prepoznajo Tollu podobni receptorji (TLR)3-5. Poleg tega naj bi ta sprememba povečala učinkovitost sinteze proteina bodice in vivo3,4,6.

Za učinkovito izražanje antigena je pomembna tudi sama zasnova molekule mRNA, le-ta mora vsebovati 5'-kapo, zapis za protein bodice, ki je obdan s 5'- in 3'-neprevajajočo se regijo (UTR), in poliadenilacijski (poliA) rep1,2,7.

Contents

5'-kapa

Molekule mRNA večceličnih organizmov na 5'-koncu vsebujejo kapo 1, tj. 7-metilgvanozin (m7G), ki je vezan na prvi nukleotid (N) molekule mRNA preko obrnjenega 5' → 5' trifosfatnega mostu (m7GpppN)8,9. Ta struktura ima več pomembnih vlog, med drugim stabilizira molekulo mRNA, pospešuje translacijo, regulira izvoz iz jedra in omogoča izrez 5'-introna10,11. Molekuli mRNA cepiva Comirnaty je na 5'-konec kotranskripcijsko dodan analog kape 1 (m7G+m3'-5'-ppp-5'-Am)1,6, ki poveča stabilnost modificirane mRNA in prepreči njeno razgradnjo12,13. Tudi na splošno se pri pripravi mRNA-cepiv vedno več uporabljajo analogi kap, saj le-ti podaljšajo življenjsko dobo molekul mRNA in povečajo učinkovitost translacije9,14,15.

5’- in 3’-neprevajajoči se regiji

Neprevajajoči se regiji sta del molekule mRNA, ki se nahajata navzgor (5'-UTR) in navzdol (3'-UTR) od kodirajočega zaporedja14 ter sta pomemben regulator translacije7. Načrtovanje, izbira in optimizacija 5'-UTR ter 3'-UTR so pri pripravi mRNA-cepiv ključni, saj zagotovijo zadostno sintezo antigena v celici7,9,15. Cepivo podjetji Pfizer in BioNTech vsebuje molekulo mRNA, katere 5'-UTR izhaja iz mRNA človeškega α-globina z optimiziranim Kozakovim zaporedjem, 3'-UTR pa sestoji iz dveh elementov, in sicer iz zaporedja mRNA proteina AES (angl. »Amino-terminal enhancer of split«) in mitohondrijske ribosomalne 12S RNA (mtRNR1)1. Razlog za takšno izbiro so izsledki predhodnih študij, v katerih so primerjali vpliv različnih endogenih zaporedij UTR na izražanje proteinov7 in ugotovili, da 5'-UTR, ki izhaja iz mRNA človeškega α-globina, pripomore k visoki učinkovitosti translacije16. Tudi elementa regije 3'-UTR nista izbrana naključno. Leta 2018 so raziskovalci Orlandini von Niessen in sod. načrtno iskali v naravi prisotna 3'-UTR zaporedja, ki bi povečala izražanje proteinov zapisanih na sintetični mRNA. Rezultati raziskave so pokazali, da kombinacija elementov AES in mtRNR1 pripomore k večji stabilnosti mRNA in izražanju proteinov17.

Zapis za protein bodice

Molekula mRNA nosi zapis za celoten, kodonsko optimiziran protein bodice1,2,6, ki se v naravi nahaja na površini virusa SARS-Cov-2 (GenBank: MN908947.3)18. V zaporedju cepiva je spremenjena skoraj tretjina nukleotidov – z namenom povečanja stabilnosti mRNA.

Zaradi lažje primerjave zaporedij zaporedje cepiva v nadaljevanju (poravnave) ne vsebuje zapisa za spremenjeno bazo (Ѱ).

Signalni peptid:

                                                   M   F   V   F   L   V   L   L   P   L   V   S   S   Q   C   V
                                           Virus: AUG UUU GUU UUU CUU GUU UUA UUG CCA CUA GUC UCU AGU CAG UGU GUU
                                          Cepivo: AUG UUC GUG UUC CUG GUG CUG CUG CCU CUG GUG UCC AGC CAG UGU GUG
                                                   M   F   V   F   L   V   L   L   P   L   V   S   S   Q   C   V

Največ sprememb v zaporedju so uvedli z zamenjavo ohlapne baze (menjava A oz. U s C ali z G), ki se na nivoju proteinov ne odražajo, saj aminokislinsko zaporedje ostane enako (sinonimne mutacije)1. Nekaj sprememb v zaporedju so uvedli tudi z drugimi zamenjavami (primer CCA → CCU v signalnem peptidu), ki zmanjšajo verjetnost nastanka sekundarnih struktur v molekuli mRNA. Te modifikacije najverjetneje prispevajo k večji stabilnosti molekule mRNA19.

Del zaporedja proteina bodice (centralna domena vijačnice):

                                                  L   D   K   V   E   A   E   V   Q   I   D   R   L   I   T   G
                                          Virus: CUU GAC AAA GUU GAG GCU GAA GUG CAA AUU GAU AGG UUG AUC ACA GGC
                                         Cepivo: CUG GAC CCU CCU GAG GCC GAG GUG CAG AUC GAC AGA CUG AUC ACA GGC
                                                  L   D   P   P   E   A   E   V   Q   I   D   R   L   I   T   G

Poleg optimizacije rabe kodona je ključna sprememba v zaporedju menjava dveh kodonov, ki se na nivoju proteinov odraža kot dve točkovni mutaciji – mutacija 2P (K986P in V987P)1,6. Ta mutacija protein bodice zaklene v antigensko preferenčno prefuzijsko obliko6,20. Leta 2017 so jo odkrili strukturni biologi, da bi stabilizirali protein virusa MERS-Cov in mu lahko določili strukturo21.

Končni del zaporedja proteina bodice:

                                                 L   D   K   G   V   K   L   H   Y   T   *   
                                         Virus: GUG CUC AAA GGA GUC AAA UUA CAU UAC ACA UAA 
                                        Cepivo: GUG CUG AAG GGC GUG AAA CUG CAC UAC ACA UGA UGA
                                                 L   D   K   G   V   K   L   H   Y   T   *   *   

Z * je označen stop kodon.

PoliA rep

Tako kot 5'-kapa, 5'-UTR in 3'-UTR je tudi poliA rep pomemben del molekule mRNA, saj ima pomembno vlogo pri stabilnost mRNA in tudi v samem procesu translacije22. Molekula mRNA v cepivu se zaključi s 110 nukleotidi. PoliA rep sestoji iz 30 adeninov, ki jim sledi 10 nukleotidov dolgo povezovalo zaporedje (GCAUAUGACU) in nato še 70 adeninov1. Povezovalno zaporedje naj bi olajšalo translacijo22.

                                       Cepivo: UAGCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGCAUAU GACUAAAAAA AAAAAAAAAA 
                                               AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA

Zaključek

Podjetji Pfizer in BioNTech sta celotno zaporedje za protein bodice spremenili v kar precejšnji meri. Večina sprememb in modifikacij je bila uvedena z namenom povečanja stabilnosti molekule mRNA in učinkovitosti translacije.

Viri in literatura

1. World Health Organization. "Messenger RNA encoding the full-lenght SARS-CoV-2 spike glycorpotein". WHO MedNet. https://mednet-communities.net/inn/db/media/docs/11889.doc (pridoblejno 22. 3. 2021)

2. International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances (INN). https://www.who.int/publications/m/item/inn-pl-124-covid (pridobljeno 5. 4. 2021)

3. Loomis, K. H. et al. In Vitro Transcribed mRNA Vaccines with Programmable Stimulation of Innate Immunity. Bioconjug. Chem. 29, 3072–3083 (2018).

4. Parr, C. J. C. et al. N 1-Methylpseudouridine substitution enhances the performance of synthetic mRNA switches in cells. Nucleic Acids Res. 48, E35 (2020).

5. Uehata, T. in Takeuchi, O. RNA Recognition and Immunity-Innate Immune Sensing and Its Posttranscriptional Regulation Mechanisms. Cells 9 (2020).

6. Vogel, A. B. et al. Immunogenic BNT162b vaccines protect rhesus macaques from SARS-CoV-2. Nature 1–7 (2021).

7. Zeng, C. et al. Leveraging mRNAs sequences to express SARS-CoV-2 antigens in vivo. bioRxiv Prepr. Serv. Biol. 2020.04.01.019877 (2020)doi:10.1101/2020.04.01.019877.

8. Grudzien-Nogalska, E., Jemielity, J., Kowalska, J., Darzynkiewicz, E. in Rhoads, R. E. Phosphorothioate cap analogs stabilize mRNA and increase translational efficiency in mammalian cells. RNA 13, 1745–1755 (2007).

9. Sahin, U., Karikó, K. in Türeci, Ö. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery 13 759–780 (2014).

10. Sikorski, P. J. et al. The identity and methylation status of the first transcribed nucleotide in eukaryotic mRNA 5′ cap modulates protein expression in living cells. Nucleic Acids Res. 48, 1607–1626 (2020).

11. Ramanathan, A., Robb, G. B. in Chan, S. H. mRNA capping: Biological functions and applications. Nucleic Acids Research 44 7511–7526 (2016).

12. CleanCap® Reagent AG (3’ OMe) | TriLink BioTechnologies. https://www.trilinkbiotech.com/cleancap-reagent-ag-3-ome.html. (pridobljeno 5. 4. 2021)

13. Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S. in DeRosa, F. The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. NPJ vaccines 5, 11 (2020).

14. Xu, S., Yang, K., Li, R. in Zhang, L. Mrna vaccine era—mechanisms, drug platform and clinical prospection. International Journal of Molecular Sciences 21, 1–35 (2020).

15. Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S. & DeRosa, F. The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. npj Vaccines 5, 1–6 (2020).

16. Babendure, J. R., Babendure, J. L., Ding, J. H. & Tsien, R. Y. Control of mammalian translation by mRNA structure near caps. RNA 12, 851–861 (2006).

17. Orlandini von Niessen, A. G. et al. Improving mRNA-Based Therapeutic Gene Delivery by Expression-Augmenting 3′ UTRs Identified by Cellular Library Screening. Mol. Ther. 27, 824–836 (2019).

18. Wrapp, D. et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science 367, 1260-1263 (2019).

19. Kudla, G., Lipinski, L., Caffin, F., Helwak, A. in Zylicz, M. High guanine and cytosine content increases mRNA levels in mammalian cells. PLoS Biol. 4, 0933–0942 (2006).

20. Lamb, Y. N. BNT162b2 mRNA COVID-19 Vaccine: First Approval. Drugs 81, 495–501 (2021).

21. Pallesen, J. et al. Immunogenicity and structures of a rationally designed prefusion MERS-CoV spike antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, E7348–E7357 (2017).

22. Trepotec, Z., Geiger, J., Plank, C., Aneja, M. K. & Rudolph, C. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life. RNA 25, 507–518 (2019).

Personal tools