Emergentne lastnosti zmanjšanega genoma E. coli

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Emergent Properties of Reduced-Genome Escherichia coli

Skupina raziskovalcev iz Evrope in ZDA je s pomočjo sintezne biologije zmanjšala genom Escherichie coli K-12 z uporabo natančnih načrtovanih delecij. Pripravili so več sevov z multiplimi delecijskimi mesti (ang. multiple deletion sites - MDS) in nekateri od njih so imeli genom zmanjšan tudi do 15%. Določili so neesencialne gene in zaporedja za eliminacijo, kljub temu pa so ohranili dobre profile rasti ter proizvodnje proteinov. Zmanjšanje genoma je vodilo tudi do nekaterih nepredvidenih izboljšav, npr. do povečane učinkovitosti elektroporacije ter večjo stabilnost rekombinantnih genov in plazmidov, ki so bili v drugih sevih nestabilni. Za stabilizacijo sevov z MDS so odstranili zaporedja za transpozicijo.

Contents

1 Uvod

1.1 Zasnova

Escherichia coli je eden najbolje analiziranih in razumljenih organizmov na svetu in je posledično prva izbira za genetske, biokemijske in metabolne raziskave. Komercialno se najpogosteje uporablja za pridobivanje metabolitov kot so aminokisline in proteini za terapevtsko ali komercialno rabo. Vse pogosteje se uporablja tudi za pridobivanje DNA za gensko terapijo, DNA vakcin in interferenčne RNA. E. coli se v naravi nahaja v prebavilih živali. Skupina je zato predvidevala, da je nekaj delov njenega genoma, ki omogoča življenje v takem okolju, nepotrebnih za določene aplikacije; morda celo nezaželenih. Namen je bil ustvariti gensko stabilen genom, kot nekakšen prazen list, ki bi mu lahko druge skupine nato poljubno dodajali izbrane gene. Redukcija genoma lahko izboljša metabolno učinkovitost in zmanjša število odvečnih genov npr. mobilnih DNA elementov, ki vplivajo na rekombinacijo preko transpozicije in horizontalnega prenosa genov. Mednje spadajo insercijske sekvence (IS), transpozaze, intergraze, defektni fagi in druge. Mnoga zaporedja omogočajo preoblikovanje genoma brez transpozaz. Ker so želeli pridobiti stabilen genom, so morali ta zaporedja odstraniti.

1.2 Zakaj bi reducirali genom?

Odstranitev nekaterih notranjih struktur, kot so fimbrije, bi omogočilo boljši dostop DNA k polarizirani membrani. Odstranitev neznane deoksiribonukleaze ali restrikcijskega sistema ali sistema privzema DNA bi lahko znatno spremenila hitrost transformacije. Odsotnost mnogih membranskih proteinov in regulatornih faktorjev ter flagelarnih struktur bi spremenila sestavo membrane in morda zmanjšala občutljivost na polarizacijo. Po drugi strani bi odsotnost nekaterih signalnih poti in regulatornih vezij pomenilo zmanjšano metabolno breme za bakterijo in povečano produkcijo želenega rekombinantnega proteina. Obnašanje sistema z zmanjšanim genomom je bolj preprosto opisati z računalniškimi modeli in bolj natančno lahko predvidimo spremembe ali odzive glede na spreminjanje parametrov. Odstranjevanje insercijskih sekvenc (IS) zmanjša število mutacij. Bakterije z zmanjšanimi genomi bi naj bile bolj robustne in odpornejše na stres, kar pride posebej prav v biotehnoloških aplikacijah. Vendar pa imajo E. coli sevi z zmanjšanimi genomi slabšo sposobnost ohranjanja tuje DNA.

2 Delecije

2.1 Določanje genov za odstranitev

Skupina je morala odstraniti točno določene gene, da spremembe ne bi vplivale na rast in razmnoževanje celic. Uporabili so serijo primerjav genomskih zaporedij, da bi določili tista, ki so prisotna v K-12 sevu, ne pa tudi drugih sevih E. coli. Analiza je pokazala skoraj 100 možnih delov genoma za delecije, ki so obsegali približno 20% celotne velikosti genoma. Najprej je skupina odstranila velike otoke z IS in posamezne gene z elementi IS. Nato so se lotili še odstranjevanja drugih neesencialnih genov, ki so jih predhodno določili. Ustvarili so seve z multiplimi delecijskimi mesti (ang. multiple deletion sites - MDS)

2.2 Metode delecije

Delecije so temeljile na sistemu rekombinacije, posredovane z bakteriofagom lambda red. To je sistem, ki se pogosto uporablja za tarčno preurejanje genoma E. coli, katerega delovanje še danes ni popolnoma pojasnjeno. Temelji na popravljanju dvojnega preloma DNA s homologno rekombinacijo. Najprej so na sevu MDS12 opravili t.i. »delecije brez brazgotin«, kjer so poleg tarčnega dela zaporedja odstranili tudi markerje, uporabljene v konstrukciji. Nato so testirali robustnost sevov v minimalnem mediju. Delecije so nato postopoma združili v en sev. Na tak način so se izognili kopičenju točkovnih mutacij. Mesta delecij so potrdili s pomočjo hibridizacije na DNA mikromrežo.

3 Rezultati

Sevi z reduciranim genomom so rasli z zelo podobnimi hitrostmi kot starševski sev. Opazili so, da je elektroporacija pri MDS sevih uspešnejša kot pri kontrolnem sevu. Uspešnost je bila pri sevu MDS42 za dve velikostni stopnji višja od starševskega seva in primerljiva s sevom DH10B, ki velja za najuspešnejšega pri elektroporaciji.

V različnih bioprocesih z dohranjevanjem so MDS sevi rasli do visokih gostot. Izražanje rekombinantnih proteinov so testirali z modelnim proteinom kloramfenikol acetiltransferazo. Izražanje je bilo primerljivo starševskemu sevu. Uspešno so izrazili tudi metil transferazo. Tako so dokazali, da so ti sevi primerni tudi za pridobivanje rekombinantnih proteinov v večjem merilu.

3.1 Težave

Sev MDS39 so načrtovali tako, da so odstranili vse IS. Pregledali so ga s hibridizacijo na DNA mikromreže, ki so vsebovale IS elemente, fage in plazmide, ki jih ni v K-12. Ugotovili so, da se je pet kopij IS preneslo na nove lokacije. V kasnejših sevih so jih sicer odstranili s specifičnimi delecijami. Transpozicije IS je med eksperimentalnim procesom težko slediti. Skupina je ugotovila, da se IS v zmanjšan genom pogosto prenesejo iz plazmidne DNA.

Za dokaz, da so MDS sevi brez mutacij, ki jih inducirajo IS, so raziskali, ali bakterije lahko rastejo na salicinu kot edinem viru ogljika. Za metabolizem salicina je potreben aktiven bgl operon (beta-glukozidni operon), kar se večinoma zgodi z insercijo IS v promotorsko regijo. Celice so kultivirali na minimalnem gojišču s salicinom kot edinim virom ogljika. Adaptacijske mutacije so zaznali pri manj kot 8% bakterij v eksperimentu. S ciklično reakcijo s polimerazo (PCR) so potrdili, da v sevih niso prisotne mutacije, odvisne od IS, ter da je število ostalih mutacij med primerjanimi sevi zelo podobno.

Čemu sploh služijo IS sekvence? Tuji geni se v E. coli pogosto ne obdržijo. Avtorji trdijo, da IS mutageneza zagotavlja zaščito pred izražanjem genov, ki se skozi evolucijo v nekaj generacijah izgubijo.

3.2 Končni rezultat

Ko je skupini uspelo razrešiti vse težave, so končali s več stabilnimi sevi, katerih genom so zmanjšali za največ 15,2% celotne velikosti genoma K-12, brez da bi poslabšali njihove fiziološke lastnosti. Po pričakovanjih so morali odstraniti vse transpozicijske elemente, niso pa predvideli povečane dovzetnosti za elektroporacijo ali povečane stabilnosti prej nestabilnih plazmidov.

4 Pogled na reduciran genom danes

Pristop minimalnega genoma želi določiti najmanjše število genetskih elementov, ki zadoščajo za sestavljanje prosto živečega celičnega organizma. Tak modelni organizem bi nam lahko pomagal razumeti prve žive organizme, ki so se pojavili na Zemlji, morda pa tudi razvoj najstarejših genomov ter razumevanje poteka zgodnje evolucije. Prvič so se zamisli o minimalnih genomih začele pojavljati okoli leta 2000, ko se je začelo število objavljenih genomov večati in so se začele razvijati tehnike anotacije, ter natančnejše tehnike za urejanje genomov. Vendar smo šele nedavno odkrili tehnike, za katere lahko trdimo, da so natančne in zelo zanesljive pri načrtovanem urejanju genoma. Nekaj virusnih in bakterijskih sintetičnih genomov je bilo že ustvarjenih. Bolje od E. coli se na zmanjšanje genoma odzovejo bakterije rodu Mycoplasma in lahko se zgodi, da bodo E. coli v nekaterih aplikacijah nadomestile. Vedno več se na tem področju raziskuje tudi Bacillus subtilis.

Zakaj torej nad 440 citatov? Ta eksperiment je služil kot temelj za večino nadaljnjih raziskav obsežnejših delecij, zmanjševanja genoma, proizvodnji umetnih kromosomov in sintetičnih genomov. Še v letu 2016 je bil citiran šestnajstkrat.

Zaključek

Skupini je uspelo doseči zastavljeni cilj – ustvariti poenostavljene, vendar stabilne genome, brez da bi zmanjšali njihove fiziološke sposobnosti. Odstranili so mesta za insercijske sekvence, ki so odgovorna za večji del mutageneze. Nenačrtovano so z zmanjšanjem genoma dosegli tudi večjo dovzetnost za elektroporacijo. Sevi z zmanjšanim genomom omogočajo preprostejše načrtovanje sprememb in manipulacijo genoma. Praviloma so zmanjšani genomi bolj odporni na stres. Njihov cilj ni bil zmanjšati genom na minimalno velikost oz. narediti sintetični genom. Na teh področjih so se bolje odrezale mikoplazme in Bacillus subtilis. Sevi z zmanjšanimi genomi (vendar ne sevi, ki jih je razvila ta skupina) se že uporabljajo v različnih bioprocesih in dajejo vzpodbudne rezultate. V prihodnosti nam bodo zmanjšani in minimalni genomi morda pomagali razumeti potek zgodnje evolucije ter razvoj življenja na Zemlji.

Viri

  1. Posfai, G. et al. Emergent Properties of Reduced-Genome Echerichia coli. Science, 2006, 312, str. 1044-1048.
  2. Mushegian, A. The minimal genome concept. Current Opinion in Genetics & Development, 2000, 9, str. 709-714.
  3. Martinez-Garcia, E. The quest for the minimal bacterial genome. Current Opinion in biotechnology, 2016, 42, str. 216-224.
  4. Mosberg, J.A., Lajoie, M. J., Church, G. M. Lambda Red Recombineering in Escherichia coli Occurs Through a Fully Single-Stranded Intermediate. Genetics, 2010, 186, str. 791-799.
Personal tools