Genetska vezja v metabolnem inženiringu

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search


UVOD

Orodja in principi, ki jih ponuja sintezna biologija imajo velik potencial za uporabo v metabolnem inženiringu, hkrati pa je za njihovo uspešno uporabo potrebno premagati še mnogo preprek. Omenjene prepreke lahko razdelimo v tri skupine, ki zajemajo: senzorje, logična vezja in tarčenje večih genov. Robustnost le teh komponent je pri metabolnem inženiringu poglavitnega pomena, saj kot rezultat želimo specifičen metabolit v visokih koncentracijah s čim manjšimi izgubami.


POMEN METABOLNO RELEVANTNIH SENZORJEV

Celice so polne senzorjev, ki omogočajo stalno kontrolo notranjega in zunanjega okolja, s posredovanjem signala pa omogočijo tudi ustrezen odziv na zaznan signal. Tak način delovanja se je ohranil tekom evolucije in ga je zato smiselno posnemati. Veliko vezij uporablja inducibilne promotorje, ki so odvisni od induktorjev dodanih v gojišče s strani raziskovalca, kar zahteva natančnejše spremljanje procesa, hkrati pa predstavlja dodaten strošek. Zaradi tega so bolj zaželjeni promotorji, ki posredno zaznavajo metabolite udeležene v željeni metabolni poti. Takšna strategija omogoča manj natančno spremljanje procesa in hkrati zniža njegove stroške. Biosenzorje je tako mogoče uporabljati za spremljanje metabolnih poti in določanje ozkih grl, nadzor pretoka metabolitov skozi metabolno pot in sintezo določenih produktov ob pravem času, kar zmanjša celični stres. Nenazadnje je cilj izboljšati donos željenega produkta, z ustvarjanjem medseboj povezanih, natančno uravnavanih vezij, ki so podobni naravnim metabolnim zankam. Senzorji so lahko pridobljeni iz narave, naravne senzorje lahko spremenimo po meri ali pa jih sintetiziramo de novo. Cilj je ustvariti knjižnico ustrezno karakteriziranih senzorjev, ki se čim bolj uspešno odzovejo na širok izbor celičnih signalov. Seveda ni nujno, da senzorji služijo le zaznavanju specifičnih metabolitov, temveč jih je potrebno razvijati tudi v smeri drugih okoljskih dejavnikov (npr. prisotnost kisika, temperatura, svetloba...). Ustrezna uporaba senzorjev bi tako omogočila prekinitev oziroma omejitev sinteze produkta v stresnih razmerah (npr. pregrevanje fotobioreaktorjev v popoldanskih urah) in s tem omogočila nepotrebno trošenje energije za sintezo proteinov. Prav zaradi tega je uporaba senzorjev, ki zaznavajo intermediatov v željeni poti ustreznejša, kar pa bi lahko izboljšali z uporabo večjega števila takih senzorjev. Poleg omejitve nepotrebnega trošenja energije lahko s tem povečamo pretok skozi metabolno pot (odvajanje produkta).


KOMPLEKSNA VEZJA

Uporaba enega senzorja za uravnavanje metabolnih poti je že uveljavljena in je že prinesla zvišanje produktivnosti. Z uporabo večih senzorjev pa pride do potrebe po kompleksnejših vezij z večimi vhodi, kar omogoča finejšo uravnavanje metabolnih in s tem izboljša specifičnost odgovora in izloči lažne pozitivne ter lažne negativne signale. Zaradi povečane kompleksnosti takih vezij pa je njihova izgradnja izjemno zahtevna, zaradi česar velikokrat ne delujejo ustrezno. Neustrezno uravnavanje lahko vodi do celičnega stresa in s tem v evolucijsko nestabilnost in nižjo produkcijo. Problematična je tudi navzkrižna reaktivnost med posameznimi komponentami, ki prav tako vodi v nepredvideno delovanje vezja. Razvoj po mnenju avtorjev ovirajo tudi tehnične pomankljivosti, med katerimi prednjačita pomankljivost pravil načrtovanja in uporaba bioloških delov v različnih sistemih, kot so tisti v katerih so bili karakterizirani. Mehanizmi s katerimi se uravnavajo vezja so številna in se neprestano dopolnjujejo. Od začetne regulacije s transkripcijskimi dejavniki se je do danes razvilo veliko novih pristopov, ki vključujejo DNA rekombinacijo, posttranskripcijsko, posttranslacijsko regulacijo in tudi medsebojne kombinacije. Raziskave z multipli vhodi so že pokazale, da se pri uspešno načrtovanih vezijh taka dinamična kontrola pokaže z višjo produkcijo. Pomembna lastnost takih vezij je, kot že prej omenjeno, tudi njihova robustnost in je zato le ta prioritetna lastnost pri načrtovanju kompleksnih vezij. Ker je večina vezij testiranih v kontroliranih pogojih taka karakterizacija ne pokaže morebitnih odstopanj v primeru sprememb, ki so večkrat prisotne ob povečevanju obsega. Dodatna težava so spontane mutacije vezja, ki lahko celici povzročijo breme, hkrati pa izgubijo načrtovano uravnavanje željene poti. Za razvoj novih načinov vezij se je zato smiselno vprašati, kakšna ne-naravna vezja so glede na razpoložljive dele možna in pa morebitne prednosti naravnih vezij pred sinteznimi (v nekaterih primerih je rezultat delovanja naravnega in sintetičnega vezja enak, vendar se je smiselno vprašati zakaj se je tekom evolucije ohranil obstoječi naraven mehanizem).


STRATEGIJE TARČENJA VEČIH GENOV

Ker metabolne poti sestavljajo številni encimi, je potrebno upoštevati dejstvo, da mora naš sistem vplivati na izražanje večih genov. Tako lahko kontroliramo tok skozi metabolne poti preko regulacije prekurzorjev, odvajanje produkta in utišanjem kompetitivnih metabolnih poti, ko so razmere v celici optimalne. Za uspešno izvedbo takšnega načina je potrebna simultana in ortogonalna regulacija. Ortogonalnost je ključnega pomena, saj želimo vplivati le na specifičen tarčen gen, nikakor pa ne želimo navzkrižne reaktivnosti. Najobetavnejši pristop so trenutno RNA molekule, saj njene interakcije potekajo preko komplementarnega parjenja, zato je njihova izdelava enostavna, hkrati pa jih je enostavno implementirati. Eden izmed načinov uporabe RNA je tudi CRISPR/Cas, ki je že bil uporabljen za konstrukcijo vezij za tarčenje večih genov. Kot nadgradnja obstaja tudi sistem kjer sgRNA vsebuje tudi vezavna mesta za druge proteine, ki lahko aktivirajo ali zavrejo ekspresijo gena. Ortogonalnost lahko dosežemo tudi pri proteinih (transkripcijski faktorji, polimeraza), kar so dokazali s proizvodnjo več variant polimeraze T7. Polimeraze so razstavili v fragmente, ki so se izražale glede na vhodne signale in se bolj ali manj selektivno vezale na svoje promotorje. Sestavili so tudi vezje, ki je omogočalo enako izražanje reporterskega proteina, kljub temu da se je nahajal enkrat na plazmidu, ki je v eni kopiji, enkrat pa na plazmidu, ki se v celici nahaja v več kopijah. Takšne strategije tarčenja več genov bi lahko skupaj z metabolno ustreznimi senzorji in kompleksnejšimi vezij kombinirali v celoto in bi služili k nadaljnem napredku metabolnega inženiringa.


STRATEGIJE NADALJNEGA RAZVOJA

S kombinacijo vseh treh komponent lahko pričakujemo razvoj metabolnih poti v smeri neodvisnosti od ostalih regulatornih komponent v celici. S skrbnim načrtovanjem bi celice, ki vsebujejo takšna vezja, lahko zaznavale spremembe v okolju (zunanjem in notranjem) in regulirale tok metabolitov v smeri željenega produkta, brez da bi ogrožale lasten obstoj. Takšna vezja naj bi glede na dosedanje raziskave olajšala delo raziskovalcem in rezultirala v višji produktivnosti. Napredovanje sintezne biologije do te stopnje pa zahteva spremembe v načinu oblikovanja, konstrukcije in testiranja vezij. Kot prvo je potrebno nadomestiti standardno uporabljene senzorje (pLac) in jih nadomestiti s takšnimi, ki imajo glede na željeni cilj večji pomen. V primeru metabolnih poti so to senzorji za intermediate in okoljske parametre. Kljub temu, da nekatere raziskave na tem področju dokazujejo izboljšanje z uporabo te strategije, so biološki deli večinoma nedostopni. Za povečanje diverzitete senzorjev in ostalih komponent vezij je zato potrebno najprej izpostaviti uspešne sisteme iskanja/izumljanja, karakterizacije in implementacije. Nadaljna pomembna lastnost kompleksnejših vezij je večkrat omenjena robustnost. Kompleksnejša vezja so namreč manj robustna, kar na krajši rok lahko pomeni stresne razmere v celici, na daljši rok pa to vodi v izgubo kontrole nad delom ali kar celotnim sistemom. V kontroliranih pogojih so nekateri že uspeli implementirati kompleksnejša vezja, vendar bi jih bilo za razširjeno uporabo potrebno prilagoditi tudi spreminjajočem se okolju. Za rešitev omenjenih problemov je pomembno raziskati tudi natančnejše mehanizme, ki pripeljejo do metabolnega bremena. Kot je razvidno iz opisanih sestavnih delov vezja: senzorja, logičnih vrat in tarčenja več genov hkrati, so naštete komponente dobro razvite in uspešno uporabljene potrebno pa jih je uspešno združiti, da bodo služile potrebam metabolnega inženiringa. Sintezna biologija tako zagotavlja ustrezna orodja za sestavo takšnih vezij, ne smemo pa zanemariti tudi razvoj orodji, ki omogočajo sestavljanje in vstavljanje vedno bolj kompleksnih vezij v tarčnih organizmih in odkrivanje kritičnih genov in njihove regulacije v posameznih metabolnih poteh.


VIRI

Hoynes-O’Connor A. in Moon T.S. Programmable genetic circuits for pathway engineering. Current Oppinion in Biotechnology, 2015, 36:115 –121

David Sprinzak D. In Elowitz M.B. Reconstruction of genetic circuits. Nature, 2005 438, 443-448 doi:10.1038/nature04335

Michener J.K., Thodey K., Liang J.C. in Smolke C.D. Applications of Genetically-Encoded Biosensors for the Construction and Control of Biosynthetic Pathways. Metab Eng. 2012 May ; 14(3): 212–222. doi:10.1016/j.ymben.2011.09.004

Nielsen A.A.K. , Segall-Shapiro T.H. in Christopher A Voigt C.A. Advances in genetic circuit design: novel biochemistries, deep part mining, and precision gene expression. Current Opinion in Chemical Biology 2013, 17:878 –892

Personal tools