Genetski programi zgrajeni iz več plasti logičnih vrat v posameznih celicah

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Povzeto po članku: Moon, T., Lou, C., Tamsir, A., Stanton, B. & Voigt, C. Genetic programs constructed from layered logic gates in single cells. Nature 491, 249-253 (2012).

Genetski programi integrirajo okoljske senzorje, izvajajo algoritme signalnega procesiranja ter kontrolirajo dinamiko izražanja [1]. Sestavljeni so iz integriranih genetskih vezij, kjer vsako posamezno izvaja različne operacije, ki obsegajo vse od digitalne logike do dinamičnih vezij [2]. Pomanjkljivost teh vezij je velikost programov, saj so osnovana na biokemijskih interakcijah znotraj omejene prostornine celice. Posledično lahko programi vključujejo le nekaj vezij [1,3].

Avtorji članka so z metodo neposredne evolucije (angl. »Direct evolution«, DE), ki posnema proces naravnega izbora za izkoriščanje proteinov in nukleinskih kislin v industrijsko ugodnih procesih, sestavili transkripcijska logična vrata IN v Escherichii coli [3, 4]. Posamezna vrata IN vključujejo dva vstopna signala (aktivatorja) ter kontrolirajo/generirajo en izstopni signal (reporterski protein). Tako se lahko vrata sestavijo v več plasti, saj je izhodni signal zgornjega vezja hkrati vhodni signal naslednjega vezja. Posamezna vrata so sestavljena iz transkripcijskega faktorja (TF) ter šaperona, ki je potreben za aktivacijo izhodnega signala. S povezovanjem vrat na več različnih načinov so raziskovalci dobili množico različnih programov, največji izmed katerih je vseboval 4 vrat IN, in je bil sestavljen iz 3 vezij ki so med seboj povezovali 4 inducibilne sisteme, torej je skupaj vključeval 11 regulatornih proteinov [3].

Contents

Sestavljanje transkripcijskih logičnih vrat IN

Vrata so bila oblikovana glede na dve omejitvi. Kot prvo, vrata so morala biti sestavljena iz raznolikih delov, da bi lahko zgradili več ortogonalnih vrat iz istih delov. Kot drugo, vhodni in izhodni signali so morali imeti skupnega prenašalca signala, ki je omogočil konstrukcijo več plasti vrat. V primeru transkripcijskih vezij so vhodni signali aktivatorji, izhodni signal pa reporterski protein [3].

Pripravili so transkripcijska vrata IN z dvema vhodnima signaloma, kjer prvi vhodni signal sproži izražanje aktivatorja, drugi vhodni signal pa sproži izražanje šaperona. Transkripcijski faktor je aktiven le, če sta izražena oba proteina, ker samo v kompleksu delujeta kot aktivator transkripcije za reporterski gen [3].

Transkripcijske faktorje in šaperone so izbrali iz gruče genov, ki kodirajo sistem sekrecije tipa III (T3SS). T3SS so edinstveni bakterijski mehanizmi, ki omogočajo posredovanje zapletenih interakcij z gostiteljskim organizmom, najdemo jih v patogenih bakterijah [3, 5]. Najbolj preučen sistem je Patogenostni Otok 1 v Salmonelli (angl. »Pathogenicity Island 1«, SPI-1). Znotraj le-tega je kodirano vezje, ki nadzoruje izražanje proteinov in izstop slednjih iz sistema z mehanizmom povratne zanke. Regulacija tega poteka preko interakcij protein – protein med efektorji (promotor pipaH), šaperona SicA, transkripcijskega faktorja InvF in efektorja SipC [3].

Geni, povezani s T3SS so zapisani skupaj znotraj genomske gruče. To olajša določanje nabora treh delov, ki bi lahko uspešno delovali skupaj. Dele so izbrali iz treh genomov (poleg Salmonelle), in sicer iz Shigelle flexneri, Yersinii enterocolitica in Pseudomonas aeruginosa. Ti vsebujejo transkripcijske faktorje, homologne InvF, in sicer MxiE v S. flexneri (27 %), YsaE v Y. enterocolitica (15 %) in ExsA v P. aeruginosa (10 %), in šaperone, homologne SicA: IpgC v S. flexneri (54 %), SycB v Y. enterocolitica (50 %) in ExsC v P. aeruginosa (13 %). Proteini so bili sintetizirani v E. coli s predhodno optimizacijo rabe kodonov. Deli znotraj treh organizmov so bili spremenjeni tako, da zadostita pogojem ortogonalnosti in da je dinamični razpon primerno prilagojen za vključitev v vrata. Nato so bili deli še dodatno modificirani za močnejši odziv ter še boljši dinamičen razpon (oznaka *). Na koncu so izvedli test ortogonalnosti. Vstavljeni deli znotraj Y. enterocolitica niso bili funkcionalni in zato jih raziskovalci niso uporabili za nadaljnje eksperimente [3].

Dele iz vsakega organizma (Salmonella, Shigella in Pseudomonas) so sestavili v 3 vrat IN z dvema vhodnima signaloma. Za karakterizacijo posameznih vrat so izbrali po dva promotorja na organizem, ki ju lahko induciramo z malimi molekulami; z arabinozo (pBAD) in anhidrotetraciklinom oz. aTc (pTet) v organizmih Salmonella/Shigella ter z AI-1 (pLux*) in aTc (pTet*) v Pseudomonas [3, 6-8]. Reporterski protein so modificirali tako, da so naredili fuzijo z rdečem fluorescenčnim proteinom (RFP). Tako so vrata IN osnovani na InvF-SicA* pokazali 73-kratno, MxiE-IpgC 14-kratno in ExsDA-ExsC 33-kratno ojačitev signala. Pokazali so tudi, da lahko vrata IN pretvorijo v vrata NE-IN na primeru sistema v bakterjii Salmonella, in sicer so pod prvi promotor v vezju dodali represor PhlF [3].

Karakterizacija logičnih vrat

Težave pri karakterizaciji vrat nastanejo zaradi njihove organizacije, saj se pri vhodnem signalu meri koncentracija sprožilcev, pri izhodnem signalu pa intenziteta fluorescence. Za dobro karakterizacijo so torej potrebne iste enote meritev pri vhodnem in izhodnem signalu, kar so raziskovalci dosegli z uporabo matematičnega modela v kombinaciji z dodatnimi eksperimenti. Moon in sodelavci so neodvisno karakterizirali aktivnost promotorjev posameznega inducibilnega sistema ter uskladili z enostavnim termodinamičnim modelom. To je dalo podlago za parametrizacijo posameznega modela vrat IN tako, da so vhodni in izhodni signali predstavljali aktivnosti ustreznega promotorja. Podatke so izrazili v enotah relativnega izražanja (angl. »relative expression units«, REU), aktivnosti so normalizirali glede na izmerjeno aktivnost konstitutivnih promotorjev z enakim reporterskim sistemom [3].

Več plasti logičnih vrat IN

Po pripravi logičnih vrat IN z dvema vhodnima signaloma so znanstveniki sestavili več plasti logičnih vrat z namenom ustvariti bolj kompleksne programe. Pripravili so logična vrata IN s tremi in štirimi vhodnimi signali s permutacijami logičnih vrat IN z dvema vhodnima signaloma. Tako kot prej so bili vhodni signali male molekule, ki inducirajo transkripcijo s promotorjev uporabljenih v vratih. Reporterski protein programa je bil prisoten le takrat, kadar so bili prisotni v sistemu vsi sprožilci. Vrata s tremi vhodnimi signali so pokazali 4,5-kratno ojačenje izhodnega signala [111] v primerjavi z najvišjem neaktivnim stanjem [011], s štirimi vhodnimi vrati pa 5,1-kratno ([1111] v primerjavi s [1011]). Dinamično obnašanje so karakterizirali z indukcijo in relaksacijo programa s 4 vhodnimi signali s preklapljanjem med stanji [0000] in [1111]. Največji genetski program je bil sestavljen iz logičnih vrat s 4 vhodnimi signali, in je potreboval 7 genetskih naprav (3 vrat in 4 inducibilne sisteme), ter je vključeval 11 regulatornih proteinov. Tako je bil slednji največji genetski program pripravljen do leta 2012 [3,9].

Napoved zmogljivosti programa

Čeprav so znanstveniki uspešno karakterizirali posamezna vezja, takšna analiza je lahko nezadostna za napoved delovanja in zmogljivosti celotnega genetskega programa. Pride lahko do razlik znotraj genetskih okvirjev, interference med vezji ali obojega hkrati, kar bi vplivalo tudi na celico. Zato so z uporabo podatkov o posameznih vratih in inducibilnih sistemih izračunali pričakovan odziv programov. Izračun so primerjali z eksperimentalnimi podatki ter ugotovili, da oba programa delujeta po pričakovanjih v vseh vhodnih stanjih [3].

Sinhronizacija programov

Ena izmed možnih težav pri več plasti logičnih vratih je lahko neusklajenost programov, torej razvoj signalov med vrati ni sinhroniziran [3,10]. Zaradi zamujanja v posamezni plasti lahko pride do začasnih napak v izhodnem signalu, oziroma okvar (angl. »faults«) [3,11]. Do okvare lahko pride recimo takrat, kadar se signal cepi in ena razvejitev spusti eno plast. Tako en signal doseže naslednjo plast hitreje kot drugi, in vrata se odzovejo na napačno kombinacijo vhodnih signalov. Posledično do okvare genetskega programa lahko pride ob zakasnitvi ene izmed plasti (med 20 in 40 min) [3].

Za preučevanje tega pojava so znanstveniki uporabili preprost kinetični model. Ob predpostavki, da so logična vrata IN sestavljena iz dveh proteinov x in y, do okvare pride kadar je zakasnitveni čas (td)

td >> (γx·γy)/(K·αx·αz·γg)


kjer K predstavlja konstanto asociacije x in y med seboj in DNA, α je hitrost izražanja, γ je hitrost razgradnje ter γg je hitrost razgradnje reporterskega proteina [3]. Preverili so možnost okvare logičnih vrat IN z 3 in 4 vhodnimi signali. Ugotovili so, da pri programih s 3 vrati je verjetnost okvare največja pri prehodu iz stanja [110] (+Ara/+IPTG/-aTc) v stanje [011] (-Ara/+IPTG/+aTc). V obeh stanjih ne bi smelo priti do transkripcije reporterja, a zaradi verjetnosti, da se bo inducibilni sistem pTet vklopil hitreje, kot se bodo izklopila prva vrata IN (MxiE-IpgC), lahko pride do okvare. Dodatno je lahko razgrajevanje šaperona SicA* prepočasno in posledično lahko pride do okvare. Tako se bo RFP izražal, dokler se šaperon ne razgradi v celoti. Eksperimentalno so znanstveniki pokazali, da do teh okvar ni prišlo, kar pomeni, da je v tem primeru izražanje transkripcijskih faktorjev počasnejše od razgradnje šaperonov. Enake poskuse so izvedli tudi za logična vrata IN s 4 vhodnimi signali, kjer tudi niso dobili dokaza za takšne vrste okvar. Predpostavljajo, da do okvar lahko pride pri programih z večjim številom vezij [3].

Zaključek

Moon in sodelavci so načrtali več genetskih vezij, ki si jih nato z različnimi permutacijami združili in tako zgradili genetske programe iz več plasti logičnih vrat. Največji program je vseboval 4 logična vrata IN ter potreboval 11 regulatornih proteinov. Za pripravo večjih vezij bi bilo potrebno uporabiti nova orodja ter bolj zmogljive računalniške programe, bolje preučiti interakcijo vezij med seboj in vpliv na gostiteljski organizem ter ugotoviti metode, ki bi zmanjšali vpliv okolja, evolucije in genetike na delovanje vezja [3].

Viri

1. Khalil, A. & Collins, J. Synthetic biology: applications come of age. Nature Reviews Genetics 11, 367-379 (2010).

2. Anderson, J., Voigt, C. & Arkin, A. Environmental signal integration by a modular AND gate. Molecular Systems Biology 3, 133 (2007).

3. Moon, T., Lou, C., Tamsir, A., Stanton, B. & Voigt, C. Genetic programs constructed from layered logic gates in single cells. Nature 491, 249-253 (2012).

4. Lutz, S. Beyond directed evolution—semi-rational protein engineering and design. Current Opinion in Biotechnology 21, 734-743 (2010).

5. Gophna, U., Ron, E. & Graur, D. Bacterial type III secretion systems are ancient and evolved by multiple horizontal-transfer events. Gene 312, 151-163 (2003).

6. ATc - OpenWetWare. Openwetware.org (2020)

7. > Part:BBa K575024 - parts.igem.org. Parts.igem.org (2020)

8. Hur, W. et al. A Small-Molecule Inducer of the Antioxidant Response Element. Chemistry & Biology 17, 537-547 (2010).

9. Purnick, P. & Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nature Reviews Molecular Cell Biology 10, 410-422 (2009).

10. Abelson, H. et al. Amorphous computing. Communications of the ACM 43, 74-82 (2000).

11. Mangan, S. & Alon, U. Structure and function of the feed-forward loop network motif. Proceedings of the National Academy of Sciences 100, 11980-11985 (2003).

Personal tools