Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo
Uvod
Cilj sintezne biologije je narediti celice z močno regulacijo in izražanjem kompleksnih funkcij. Slednje zanje predstavlja veliko breme, kar rezultira v negativni evolucijski stabilizaciji in posledično izgubi željene funkcije. Tako smo omejeni na vstavljanje genov, ki so za celico netoksični in ne odražajo bremena. Pri večceličnih sistemih in nekaterih mikroorganizmih pride do diferenciacije celic, ki opravljajo specifično vlogo in tako prevzamejo del bremena celotne kulture. Pri takšnih sistemih govorimo o delitvi dela, ki je lahko metabolična ali reprodukcijska. Naravni sistemi uporabljajo diferenciacijo za koordinacijo pomembnih in esencialnih funkcij. Williams in Murray sta razvila diferenciacijsko strategijo, kjer bi na dane celice aplicirali neesencialne funkcije (niso pomembne za celično preživetje), hkrati pa predstavljajo breme in ovirajo celično rast [1,2]. Diferenciacijska strategija temelji na razdelitvi dela dveh pomembnih funkcij, to sta reprodukcija in izražanje funkcije željenega gena. Hkrati preprečuje selekcijo nastanka mutacij, ki našo funkcijo omejujejo. Razvili so sistem, ki je sestavljen iz dveh celičnih tipov: progenitorske celice, ki so specializirane za replikacijo kodirane funkcije in diferencirane celice, ki kodirajo funkcijo izražajo. Slednje se lahko neskončno delijo. Delitev so omejili preko uporabe rekombinacije z Bxb1 integrazo in omogočili aktivacijo ekspresije bremenske funkcije, ki je pod kontorlo T7 RNA polimeraze. Hkrati so povzročili inaktivacijo izražanja π proteina, ki je esencialen faktor za replikacijo plazmida R6K. Ob delitvi in rasti diferenciacijskih celic pride do izgube plazmida R6K, proliferacijo lahko nato omejimo s selekcijo antibiotikov. Takšne diferenciacijske celice so omejene preko t.i. terminalne diferenciacije (celice se ne morejo več delit). Ekspresija željenega gena se ne aktivira pred diferenciacijo, zato v progenitorskih celicah ni selekcijskega pritiska na mutacije, ki to funkcijo ovirajo. Terminalna diferenciacija diferenciranih celic omeji razširitev takšnih mutacij v populaciji. Celice s terminalno diferenciacijo povečajo evolucijsko stabilnost in so bolj odporne na mutacije, ki zmanjšajo ekspresijo bremenskega gena [1,3].
Rezultati
Razvoj diferenciacijskega sistema
V osnovi je prvotna populacija izvajajočih/producirajočih (angl. producer cells) celic imela zmanjšano porast, zaradi bremena, ki je povezan z željenim genom. Preko t.i. bremenskih mutacij, ki inaktivirajo izražanje našega gena, pride do namnožitve neizvajajočih/neproducirajočih (angl. non-prudcer cells) celic, ki ne izražajo željene funkcije in imajo normalno rast. Da pride do nastanka neproducirajočih celic, morata reprodukcija in ekspresija željene funkcije nastati v isti celici. Strategija terminalne diferenciacije omogoči ločitev teh dveh lasnosti preko razdelitve dela in posledično omogoči ohranjanje ekspresije željenega gena.
Za ločitev prej omenjenih lastnosti so razvili sintezno biološki sistem, kjer so v genom E.coli vstavili gen za bakteriofagno serinsko integrazo Bxb1. Za nastavljanje ekspresije Bxb1 in posledično stopnje diferenciacije, so uporabili preko salicilata inducibilen promotor PSalTTC in njegov transkripcijski faktor NahR. V sam genom so hkrati vstavili gen za T7 RNA polimerazo. Gen so postavili pod IPTG inducibilni promotor PTac , skupaj z LacI represorjem. Da so omejili proliferacijo diferenciranih celic v primeru terminalne diferenciacije, so tarčili replikacijo R6K plazmida, ki je odvisna od π proteina (kodira ga gen pir). Za to so uporabili inducibilni promotor PLasAM in njegov transkripcijski faktor LasRAM za kontrolo ekspresije π proteina. Kaseto so postavili tako, da v primeru rekombinacij preko integraze pride do njegove izključitve in π protein se ne izraža več. Obilica π proteina in število kopij R6K plazmida se v času diferenciacije lahko nastavljata preko Las-AHL promotorja. R6K plazmid kodira tudi za odpornost na kloramfenikol. Preko nivojev izražanja π proteina slednji omeji število kopij plazmida v času diferenciacije ob prisotnosti selekcije s kloramfenikolom. Delovanje T7 RNA polimeraze so preverjali preko plazmida ColE1-AmpR, ki je vseboval zapis za sfGFP (bremenska funkcija), ki je pod promotrojem PT7. Začetno vezje so skonstruirali tako, da je zapis za polimerazo sledil za genom pir, kar se je v progenitorskih celicah odražalo kot puščanje promotorja. Za preprečitev tega, so gen razcepili preko inserta za π protein. Na mestih deljene T7 RNA polimeraze so primerno umestili rekombinacijska mesta, kamor se je lahko vezala Bxb1 integraza. Slednja je ob vezavi povzročila delecijo inserta z genom pir in nastanek funkcionalne T7 RNA polimeraze. Ta se veže na PT7 ColE1-AmpR plazmida in aktivira transkripcijo željenega gena. Ob odsotnosti Bxb1 integraze, je bilo sfGFP izražanje enako kot pri negativni kontroli brez RNA polimeraze. Induciranje z Bxb1 je povzročilo povišanje koncentracije T7 RNA polimeraze in posledično povečanje izražanja sfGFP. Opisan sistem so opazovali v progenitorskih celicah, diferenciranih celicah in terminalno diferenciranih celicah.
Optimizacija diferenciacijskega sistema
Problem, ki se pojavi, je, da je pri tako obremenjenih sistemih pride do t.i. diferenciacijskih mutacij. Slednje progenitorskim celicam onemogočijo diferenciacijo. Z zmanjšanjem verjetnosti, da takšne mutacije nastanejo, se podaljša čas izražanja funkcije pri terminalni diferenciaciji (zakasnimo pojav nediferenciacije). V prvotnem primeru so imeli le eno T7 RNA polimerazno kaseto, ki aktivira izražanje željenega gena in hkrati omeji rast diferenciranih celic. Ena mutacija, ki preprečuje rekombinacijo naše kasete, bi bila dovolj, da onemogoči selekcijo preko antibiotika in povroči kupičenje bremenskih mutacij. Če v naš sistem vključimo dve T7 RNA polimerazni kaseti, kjer vsaka kodira za polovico π proteina, potrebujemo oba dela, da dobimo funkcionalen protein π. Tako bi v primeru le ene rekombinacije (ob delovanju integraze) prišli do neaktivnega π proteina in do zmanjšanja replikacije R6K plazmida. Za pojav nediferenciacije v podvojenem sistemu bi tako potrebovali dve neodvisni mutaciji. Dan sistem so naredli preko vezave Cfa-inteina na N- in C- terminalni del π proteina. Ob odsotnosti integraze pride do nastanka funkcionalnega proteina. 1x (ena kaseta s T7 RNA polimerazo) in 2x (dve kaseti s T7 RNA polimerazo) vstavljen sistem sta imela v genomu zapis za dve integrazni kaseti. Celice s dvakratnim sistemom, so bile bolj občutljive na koncentracijo Las-AHL (N-(3-oxododekanoil)-L-homoserin lakton) kot celice z enkratnim sistemom. Opazovali so kakšen je odziv neterminalno diferenciarnih in terminalno diferenciranih celic (pri 1x in 2x vstavljenem sistemu) na različne koncentracije salicilne kisline (promovira izražanje integraze). Ugotovili so, da je bil podvojen sistem nekoliko bolj občutljiv na koncentracijo Las-AHL (10-30 µM). Da so lahko lahko pozitivne učinke diferenciacije in terminalne diferenciacije potrdili, so slednji poskus izvedli na osnovnih nediferenciranih celicah. Slednje so izražale bremensko funkcijo in opravljale funkcijo replokacije.
Odpornost na toksične funkcije
Glede na prejšnje rezultate so predostavili, da bi tako diferenciran sistem omogočil izražanje toksičnih funkcij, ki rezultirajo v celični lizi. Da bi slednje potrdili, so kot gen uporabili dnaseI (DNAzaI). Predpostavili so, da se v progenitorskih celicah brez T7 RNA polimeraze DNAzaI ne bi izražala, zato njena toksičnost ne pride do izraza. Problem je nastal, ker so uporabili isti plazmid ColE1-AmpR, kot doslej, le da so namesto sfGFP vstavili zapis za DNAzoI. Prišlo je do nastanka mutiranih plazmidov, ki so puščali. Da bi to preprečili, so vključili dva izolirana terminaroja pred T7 RNA polimerazni promotor promotor (je ublažilo puščanje), hkrati so zmanjšali moč RBS. Slednje je rezultiralo v izražanju pravilnega dnaznega konstrukta. Pri enojnem in dvojnem sistemu v celicah skupaj z danim plazmidom, so te zrastle ~600 cfu in ~1000 cfu, medtem ko pri enojnem in dvojnem sistemu v osnovne progenitorskem sevu zrastlo 1 in 0 kolonij. Kot kontrolo so vzel kolonijo s plazmidom za GFP, ki je imela več kot 104 kolonij.
Zaključek
Celice lahko v naravi opravjajo različne funkcije, ki so lahko sintetsko bolj ali manj zapletene. Slednje želimo doseči tudi v laboratorijih, a vstavljanje različnih vezij za celico predstavlja veliko breme. Slednje rezultira v veliki evolucijski nestabilnosti in izgubi željenega produkta. Da bi preprečili izgube izraženega produkta, so v sev E.coli (JS006) vstavili sintezno biološki sistem za diferenciacijo in terminalno diferenciacijo celic. Slednje izražajo željeno funkcijo pod vplivom T7 RNA polimeraze. Omejevanje rasti diferenciranim celicam rezultira v odpornosti na bremenske nivoje in mutacije. Preko zmanjšanja bremenskih mutacij se porast nediferenciranih celic upočasni in se izboljša evolucijska stabilnost terminalno diferenciranih celic ter posledično željena funkcija. Terminalna diferenciacija je odporna tudi proti mutacijam plazmida, saj na pram diferenciranim in nediferenciranim celicam njegove efekte ublaži. Dvakratno uporabljen sistem pa se je izkazal kot učinkovito v primeru uporabe izražanja toksičnega gena. Terminalno diferencirane celice so imele veliko porast glede na nediferencirane. Slednje na gojišču niso zrastle. Rezultati nakazujejo, da je skonstruiran sistem uporaben za izražanje toksičnih funkcij, brez da bi prišlo do popolne lize celic v kulturi.
Viri
[1] R.L. Williams, R.M. Murray. Integrase-mediated differentiation circuits improve evolutionary stability of burdensome and toxic functions in E. coli. Nat Commun. 2022,13, 6822.
[2] J. van Gestel, H. Vlamakis, R. Kolter, Division of Labor in Biofilms: the Ecology of Cell Differentiation. Microbiology Spectrum. 2015, 3.
[3] K. E. McGinness, T. A. Baker, R. T. Sauer, Engineering Controllable Protein Degradation. Molecular Cell. 2006, 22, 701–707.
