Kombinatorični inženiring intergenskih regij v operonih uravnava izražanje več genov

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Izvorni članek: Pfleger, B. F., Pitera, D. J., Smolke, C. D., Keasling, J.D. Combinatorial engineering of intergenic regions in operons tunes expression of multiple genes. Nat. biotechnol. 24, 1027-1032 (2006). [1]


Contents

Uvod

Številne aplikacije sintezne biologije zahtevajo uravnoteženo izražanje več genov. Čeprav operoni omogočajo koordinirano izražanje več genov v prokariontih in eukariotih, pa je koordinacija številnih post-transkripcijskih procesov, ki določajo relativno raven genske ekspresije v operonih, precejšen izziv. V izbranem članku so istočasno nastavljali izražanje več genov znotraj operonov tako, da so generirali in pregledali velike knjižnice TIGR (nastavljive intergenske regije, angl. tunable intergenic regions), ki vsebujejo kontrolne elemente, ki vključujejo sekundarne strukture mRNA, RNazna cepitvena mesta in zaporedja z »zaplenjenimi« RBS. Uporabili so operonski reporterski sistem, ki vsebuje gena, ki kodirata za rdeči fluorescenčni protein DsRed (rfpEC) in zeleni fluorescenčni protein GFP (gfpUV). Na ta način so lahko merili relativno gensko ekspresijo, ki izhaja iz knjižnic TIGR.


Nastanek knjižnice TIGR zaporedij

Veliko knjižnico TIGR zaporedij (>10^4) so sestavili s kombiniranjem štirih nizov oligonukleotidov z uporabo PCR. Vsak oligonukleotid je vseboval dve 15-nt zaporedji, ki sta bili komplementarni zaporedju v sosednjem oligonukleotidu, tako da je bila po več krogih PCR ustvarjena serija himernih molekul DNA, ki so vsebovale oligonukleotide iz vsakega od štirih nizov. Med hibridizacijskimi zaporedji na obeh koncih vsakega oligonukleotida je bilo variabilno zaporedje z raznolikimi značilnostmi. Za kloniranje knjižnice TIGR med reporterska gena so uporabili specifična restrikcijska mesta, ki so jih vključili v pomnoževalne primerje.

Oligonukleotidi, ki so jih uporabili za nastanek TIGR, so bili načrtovani tako, da TIGR vsebuje tri regije, dve variabilni lasnični zaporedji (5' lasnica je sestavljena iz oligonukleotidov 1 in 2, 3' lasnica iz 3 in 4), ki obkrožata eno-verižno regijo (iz oligonukleotidov 2 in 3), ki vključuje različna mesta za RNazo E. TIGR zaporedja, ki vsebujejo endonukleazno mesto, se po transkripciji razcepijo na dva sekundarna transkripta, katerih stabilnost je odvisna od sekundarnih struktur, ki obkrožajo RNazno mesto. Vsak izmed 4 uporabljenih setov je vseboval 9 do 11 oligonukleotidov, iz katerih so tako generirali več kot 10^4 možnih TIGR. Čeprav je vključevanje degeneracij pri nekaterih oligonukleotidih in uporaba PCR pogojev z napako povečala število možnih kombinacij zaporedij, je bila dejanska velikost knjižnice določena s številom klonov, dobljenih po elektroporaciji.

Fluorescenca transformiranih celic

Celice, ki so nosile reporterske knjižnice, so pokazale širok spekter fluorescenčnih fenotipov. Celice, ki so močno fluorescirale, so izolirali s fluorescenčno citometrijo, da bi dodatno okarakterizirali knjižnico. Kulture razvrščenih celic so gojili v plošči s 96 vdolbinami, da so določili fluorescenco vsakega konstrukta po 24 urah. Relativno razmerje fluorescenc, rdeče- zeleno, se je razlikovalo za dva reda velikosti (od 45:1 DsRed/GFP do 3:1 GFP/DsRed), odvisno od intergenske regije. Kot so pričakovali, so se porazdelitve relativnih nivojev mRNA (te so določili z PCR v realnem času in dot blot hibridizacijo) in razmerij fluorescenc razlikovale, kar kaže, da lahko TIGR vplivajo tudi na translacijo. TIGR zaporedja so na splošno imela močnejši vpliv na ekspresijo gena na 3' od TIGR kot na gen na 5' od TIGR.


Učinki TIGR na izražanje genov

Da bi okarakterizirali mehanizme, ki so odgovorni za dobljena razmerja izražanja, so sekvencirali operone iz petnajstih plazmidov. Za veliko zaporedij so predvidevali, da tvorijo sekundarne strukture z variabilno velikostjo lasnic in enoverižnih regij. Sekundarne strukture in velikostna porazdelitev transkriptov (ocenjena iz analize northern blota) kažejo, da so za opažene razlike v izražanju genov v knjižnici odgovorni vsaj trije mehanizmi, ki so podrobneje opisani v nadaljevanju.

Diferencialno procesiranje mRNA

V zvezi z intergensko cepitvijo in diferencialnim procesiranjem sekundarnih mRNA so pokazali, da je vključitev RNaznih mest med dve kodirajoči regiji transkripta ločila stabilnost teh kodirajočih regij in s tem proizvodnjo ustreznih proteinov. Večina vzorcev v knjižnici TIGR je imela dva različna transkripta z dolžinami približno 1.800 in 800 baz, ki ustrezata predvidenim primarnim (gfpUV in rfpEC kodirajoči regiji na enem transkriptu) in sekundarnim transkriptom (gfpUV ali rfpEC kodirajoča regija). To kaže na cepitev, zaradi katere nastaneta dva neodvisna sekundarna transkripta, katerih stabilnost in na koncu količina proizvedenega proteina sta odvisni od preostalega TIGR zaporedja na 3'- in 5'-koncih ločenih transkriptov. Razlike v intenzivnosti lis primarnih in sekundarnih transkriptov po northern blotu kažejo na različno stabilnost transkriptov.

Terminacija transkripcije

Kar zadeva terminacijo transkripcije, bi lahko ustvarili velika razmerja v ekspresiji prvega gena glede na drug gen s povečanjem frekvence terminacije pred transkripcijo 3' gena. V knjižnici TIGR je bila celotna porazdelitev razmerij fluorescence zamaknjena pri skoraj 70 % klonov, ki kažejo več rdeče fluorescence (prvi gen) kot zelene fluorescence (drugi gen). Najverjetnejša razlaga za popačenost razmerja v prid prvega gena je prezgodnja prekinitev transkripcije zaradi velikih intergenskih sekundarnih struktur med kodirajočimi območji, to so pojasnili s konkretnim primerom. Predvideva se, da vzorec 1 TIGR vsebuje dve zelo veliki lasnici z več kot 20 bp v vsakem steblu. Northern blot analize so pokazale veliko količino stabilnega rfpEC transkripta, ki ustreza velikosti posameznega gena, in zelo malo gfpUV transkripta, bodisi polne dolžine bodisi transkripta, ki vsebuje samo gfpUV. Močne lasnice v tem TIGR lahko spodbudijo prezgodnjo prekinitev transkripcije in/ali zaščitijo pred eksoribonukleazami. Oba mehanizma povečata razmerje številčnosti prvega genskega produkta glede na drugi genski produkt (rdeče/zeleno).

Preprečitev vezave RBS

Končno je zaplenitev RBS povzročila številne vzorce, ki kažejo bistveno razliko med relativnimi nivoji mRNA in proteinov (sl. 2c, d in dopolnilna slika 1). V mnogih od teh vzorcev je bil gfpUV RBS del sekundarne strukture, tako da je cis-bazno združevanje RBS lahko preprečilo, da bi se ribosom naložil na transkript. Sekundarne strukture, ki vključujejo RBS, zmanjšujejo stopnjo začetka translacije. Vzorec 3, ki najbolje ponazarja ta mehanizem, je sestavljen iz štirih lasnic, od katerih zadnja vključuje RBS na dnu njenega stebla. Kljub veliki količini gfpUV mRNA (polne dolžine in sekundarnih transkriptov, ki vsebujejo samo gfpUV) je bilo zelo malo zelene fluorescence, kar kaže, da se ribosom ni mogel naložiti na 5' RBS druge kodirajoče regije.


Optimizacija sinteze mevalonata v E. coli z uporabo TIGR metode

Po tem, ko so uspešno pokazali, da lahko s TIGR kontroliramo ekspresijo reporterskih genov v operonu, so pristop uporabili za optimizacijo pretoka skozi heterologno mevalonsko pot, uvedeno v Escherichia coli, da bi proizvedli amorfa-4,11-dien, prekurzor antimalarijskega zdravila artemisinin. Heterologna mevalonatna pot, ki obsega tri gene Saccharomyces cerevisiae, spremeni acetil-CoA v izoprenoidna prekurzorja, izopentenil pirofosfat in dimetilalil pirofosfat. Čeprav se zdi, da operon, ki je sestavljen iz prvih treh genov v mevalonatni poti (atoB, HMGS, tHMGR; skupinsko imenovan MevT), omejuje pretok, je prekomerna ekspresija tega operona zmanjšala rast in tvorbo produktov, kar je verjetno posledica toksičnosti neuravnoteženega izražanja genov.

Usmerjeni pristopi za odpravo tega neravnovesja bi bili težki in zamudni. Uporaba kombinatoričnega pristopa, opisanega zgoraj, pa je zmanjšala čas optimizacije poti in povečala število in raznolikost mehanizmov, ki so jih raziskali za uravnoteženje poti MevT. Knjižnice TIGR so uporabili za generiranje serije operonov, ki so jih nato pregledali za povečano proizvodnjo mevalonata. Uporabili so megaprimer PCR pristop za hkratno postavitev knjižnic TIGR med prvi in drugi gen ter med drugi in tretji gen MevT operona. Funkcionalni operoni iz knjižnic so bili izbrani s transformacijo plazmidne knjižnice v E. coli DP5, sev, ki je izdelan tako, da je avksotrofen za mevalonat. Plazmide so nato izolirali, transformirali v produkcijski sev (DH10B) in pregledali, da bi identificirali najbolj produktivno različico. To so naredili z uporabo mevalonskega avksotrofa, transformiranega s plazmidom, ki je vseboval konstitutivno izražen gfp kot biosenzor za mevalonat. Rast tega seva, ki so ga uporabili kot zaslon, je odvisna od količine mevalonata, ki ga v okolico izloči produkcijski sev. Ker je transformiran s plazmidom, ki vsebuje zapis za GFP, pa se njegova stopnja rasti prevede v intenziteto zelene fluorescence. Od več kot 600 pregledanih kolonij je bilo 18 % signifikantno bolj fluorescirajočih od prvotnega operona (kontrola brez TIGR).

Iskanje mehanizma, ki je odgovoren za povečano proizvodnjo mevalonata

Štiri najboljše so pregledali, da bi določili mehanizem, ki je odgovoren za povečano proizvodnjo mevalonata. Najbolj očitna razlika med vzorci knjižnice in pBad33MevT kontrolo je bila izboljšana rast sevov knjižnic. Kulture neinduciranega DH10B, ki vsebujejo pBad33 (prazen vektor) ali pBad33MevT (originalna pot, brez TIGR), so rasle podobno. Ko pa so bile inducirane, so kulture, ki so vsebovale pBad33MevT, rasle mnogo počasneje kot tiste, ki so nosile pBad33. Čeprav so bile končne gostote kulture podobne, je prazen vektor dosegel stacionarno fazo skoraj 12 ur prej. Neinducirane kulture DH10B, ki vsebujejo enega od vsakega knjižničnega plazmida, so rasle podobno kot drugi neinducirani sevi. Ko pa so bili inducirani, so rasli hitreje kot pBad33MevT in počasneje kot pBad33. Proizvodnja mevalonata iz sevov knjižnic je bila sedemkrat večja od proizvodnje pBad33MevT, v povprečju 6 mM po 24 urah. Specifična produkcija sevov knjižnice je bila dvakrat večja od pBad33MevT kontrole, kar kaže, da sta tako izboljšana rast kot povečan tok skozi pot prispevala k povečani proizvodnji.

Transkripti iz vsakega seva so bili pregledani z uporabo dot blota, da bi ugotovili, ali so spremembe v zaporedju TIGR spremenile relativne nivoje izražanja treh genov. Nivoji transkriptov HMGS in tHMGR so bili opazno zmanjšani v sevih knjižnic v primerjavi s transkripti, izraženi s pBad33MevT. Zmanjšanje izražanja niso pričakovali, vendar kaže, da je bila zmanjšana ekspresija HMGS in tHMGR odgovorna za izboljšano rast in povečano proizvodnjo mevalonata.

Zaporedja TIGR iz vsakega od štirih sevov, ki so najbolje proizvajali mevalonat, naj bi tvorila majhen set podobnih struktur. Predvidevali so, da naj bi TIGR med HMGS in tHMGR tvoril veliko lasnico ali kratko enoverižno strukturo, medtem ko naj bi TIGR med atoB in HMGS vseboval dve majhni lasnici, ločeni z nekaj enoverižnimi bazami. Druga od teh lasnic naj bi zaplenila RBS, s čimer se bi zmanjšala proizvodnja HMGS. Zmanjšana hitrost translacije lahko posledično vpliva na stabilnost mRNA in s tem na raven sporočil, tako da zmanjša pokritost transkriptov z ribosomi in prepusti transkript prost za razgradnjo z RNazami. Zato bi lahko zmanjšane stopnje translacije HMGS privedle do zmanjšanja sporočil HMGS in tHMGR, kar bi bilo povezano z izboljšano rastjo in povečano proizvodnjo mevalonata.


Zaključek

Možnost dostopa do več regulatornih mehanizmov hkrati brez posebne zasnove je glavna prednost pristopa TIGR. Najpomembneje je, da lahko vključitev optimiziranega operona v prokariontski sev, ki je zasnovan za proizvodnjo artemisinina ali njegovega prekurzorja (amorfadiena), z uporabo te poti zmanjša stroške proizvodnje zdravil. Podobno je lahko uporaba TIGR, ki vsebujejo IRES elemente in RNazna mesta, koristna tudi za oblikovanje operonov, ki se uporabljajo pri inženirskih poteh, proizvodnji proteinov z več podenotami in genski terapiji pri evkariontih.

Personal tools