Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Povzeto po: Green, A. A. et al. Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. Nature 548, 117–121 (2017)


Sintezna biologija z vpeljavo inženirskih pristopov v biološke sisteme rešuje različne težave na področju biotehnologije in medicine. S pomočjo sintetičnih bioloških vezij so namreč znanstveniki sposobni ustvariti biološke naprave oz. sisteme, ki omogočajo najrazličnejše celične funkcije z uravnavanjem prisotnosti specifičnih komponent. Biološka vezja so večinoma osnovana na proteinskih regulatorjih, vendar ker je takšna vezja težavno nadgrajevati v bolj kompleksne sisteme, so se pojavile potrebe po alternativnih pristopih [1,2].

Eno izmed možnih rešitev predstavljajo biološka vezja na osnovi molekul RNA, ki posedujejo številne prednosti za uporabo v sintezni biologiji. Poleg visoke modularnosti in predvidljivega parjenja baz, s čimer je omogočeno učinkovito in silico načrtovanje molekul RNA, imajo takšna vezja tudi kolokalizirano senzorsko domeno z izhodnim signalom, s čimer se zmanjša izguba signala [2].

Contents

Ribonukleinska biološka vezja

Pri bioloških vezjih, ki so sestavljena izključno iz molekul RNA, celotna regulacija poteka na posttranskripcijski ravni, kar zmanjša časovni zamik med sprožitvijo in zaznavo signala ter prav tako izboljša zanesljivost prenosa signala. Osrednjo komponento ribonukleinskih vezij predstavljajo vrata RNA, ki so sestavljena iz zaznavne domene in reporterskega gena. V članku, ki ga povzemam, je reporterski gen predstavljal zapis za zelen fluorescenčni protein z mutacijama S65G in S72A ter degradacijsko oznako ASV (GFPmut3b-ASV) [3], medtem ko zaznavno domeno vrat RNA predstavljajo stikala 'toehold'. Ta stikala tvorijo sekundarno strukturo lasnice, ki vsebuje ribosom vezavno mesto (RBS) in START kodon. Struktura lasnice onemogoča translacijo reporterskega gena, ki se omogoči šele po vezavi sprožilne molekule RNA, saj ta z vezavo na komplementarno zaporedje na stikalu 'toehold' poruši njegovo sekundarno strukturo. Vhodni signal torej tudi predstavljajo molekule RNA [2].

Na podlagi poznavanja interakcij med dušikovimi bazami je torej moč skonstruirati vhodne molekule RNA in vrata RNA tako, da se med seboj povezujejo na različne načine in s tem omogočajo izvrševanje logičnih operacij ALI, IN ter IN-NE, prav tako pa jih je možno združiti v kompleksnejša vezja.

Logične operacije

Z natančnim in silico načrtovanjem konstruktov RNA je možno izvajanje različnih logičnih operacij z RNA-napravami. Večino poskusov s temi napravami so avtorji članka izvedli v celicah Escherichia coli seva BL21 Star DE3, ki vsebuje mutacijo v genu, ki zapisuje za RNazo E, zato so RNA molekule v celicah tega seva bolj stabilne. Zapisi za vrata RNA in vhodne molekule RNA so se večinoma nahajali pod T7 promotorjem, njihova transkripcija pa je bila inducirana z IPTG [2].

Pri izvedbi poskusa za logično operacijo IN-NE so bile uporabljene celice E. coli seva MG1655Pro. V tem primeru je bila transkripcija vrat RNA konstitutivna, saj se je zapis nahajal pod promotorjem proD, medtem ko je bila transkripcija sprožilne in deaktivirajoče molekule RNA inducirana z anhidrotetraciklinom (aTc) in IPTG [2].

Poskuse so izvedli v prisotnosti (1) in odsotnosti (0) posameznih sprožilnih molekul RNA ter pri tem merili nivo izhodne fluorescence s pretočno citometrijo. Na podlagi razmerja izhodne fluorescence so okarakterizirali izhodni signal kot VKLOP (1) ali IZKLOP (0) za posamezna logična vrata [2].

Logična vrata ALI

Pri logičnih vratih ALI dobimo izhodni signal VKLOP že v prisotnosti enega izmed ustreznih vhodnih signalov. To za celično računanje z RNA-napravami pomeni, da je potrebno vrata RNA za izvedbo te logične operacije načrtati tako, da poleg reporterskega gena vsebujejo stikalo 'toehold' za vsako posamezno sprožilno RNA. Delovanje takšnih logičnih vrat ALI je namreč možno zaradi sposobnosti ribosoma, da lahko, ko se enkrat veže na že aktivirano stikalo 'toehold', izvede translacijo tudi preko nerazvitih lasnic. Torej bo prišlo do translacije reporterskega gena tudi v primeru, ko bo prisotna le sprožilna RNA prvega stikala 'toehold' in bo drugo stikalo ostalo nerazvito. Zato je tudi pomembno, da so posamezna stikala in zapis za GFP v istem bralnem okvirju [2].

Najprej so delovanje logičnih vrat ALI (tabela 1) preverili na primeru dveh vhodnih signalov. Signala A in B sta predstavljala molekuli RNA, ki sta bili komplementarni zaporedjema A* in B* na stikalih 'toehold'. Kot nesprožilni molekuli RNA so uporabili signala X in Y. Tako so izvedli 4 poskuse v prisotnosti različnih kombinacij vhodnih molekul RNA [2].

Tabela 1: Pravilnostna tabela ALI.
signal A signal B kombinacija RNA molekul GFPmut3b-ASV
0
0
X+Y
0
1
0
A+Y
1
0
1
B+X
1
1
1
A+B
1


Rezultati so pokazali najmanj 400-kratno povečanje signala ob prisotnosti vsaj ene izmed sprožilnih RNA v primerjavi z odsotnostjo obeh [2].

Nato so izvedli poskuse z ALI logičnimi vrati tudi na primeru večih (4, 5 in 6) vhodnih signalov. Pri povečevanju števila vhodnih signalov so opazili, da kljub močnemu GFP signalu za logično pravilno stanje, se ta znatno razlikuje med posameznimi sprožilnimi molekulami RNA. Opaziti je bilo namreč višji signal pri sprožilnih RNA, ki so se vezale na stikalo 'toehold' bližje reporterskemu genu, v primerjavi s tistimi, pri katerih se je stikalo 'toehold' z njihovim komplementarnim zaporedjem nahajalo dlje od reporterskega gena. Te variacije je moč pripisati vplivu nerazvitih lasnic na translacijo ribosoma. Prav tako je možno, da se razlika v jakosti signala pojavi zaradi dodanih aminokislinskih ostankov na N-koncu reporterskega proteina [2].

Logična vrata IN

Pri logičnih vratih IN z dvema vhodoma dobimo izhodni signal VKLOP le ob prisotnosti obeh ustreznih signalov. Za izvedbo takšne logične operacije je pri RNA vratih potrebno le eno stikalo 'toehold', ki pa mora omogočiti vezavo obeh sprožilnih RNA, zato je vezavno zaporedje na tem stikalu razdeljeno na dva dela, ki sta komplementarna posamezni sprožilni molekuli RNA. Prav tako so sprožilne RNA za uporabo pri logični operaciji IN razdeljene na dva dela. En del omogoča vezavo na stikalo 'toehold', medtem ko je drugi del zadolžen za vezavo na drugo sprožilno molekulo RNA. Tako se po transkripciji obe sprožilni molekuli RNA med seboj povežeta in se skupaj vežeta na stikalo, s čimer ga aktivirata in povzročita translacijo reporterskega gena [2].

Da se prepreči aktivacija stikala in translacija v prisotnosti le ene sprožilne RNA molekule, so stikala 'toehold' v logičnih vratih IN skonstuirana na način, da se po vezavi obeh sprožilnih RNA razvije le spodnji del RNA lasnice. Tako se po razvitju spodnjega debla lasnice RBS še vedno nahaja znotraj zanke, vendar je zaradi šibke vezave zgornjega dela debla omogočena vezava ribosoma in začetek translacije [2].

Delovanje logičnih RNA vrat IN (tabela 2) so najprej preizkusili na primeru dveh vhodnih signalov. Sprožilni molekuli RNA sta predstavljala signala A1 in A2, medtem ko so kot nekomplementarni molekuli RNA uporabili signala X in Y [2].

Tabela 2: Pravilnostna tabela IN.
signal A1 signal A2 kombinacija RNA molekul GFPmut3b-ASV
0
0
X+Y
0
1
0
A1+Y
0
0
1
A2+X
0
1
1
A1+A2
1


Rezultati so pokazali 900-kratno povečanje signala ob prisotnosti obeh sprožilnih molekul v primerjavi z ostalimi tremi, logično nepravilnimi stanji [2].

Tako kot pri logični operaciji ALI so tudi z logičnim vrati IN izvedli poskuse z več (3, 4 in 5) vhodnimi signali. Pri teh poskusih se sprožilne molekule RNA med seboj povežejo v večje strukture, ki se nato skupaj vežejo na eno stikalo 'toehold'. Tudi pri poskusih z več vhodnimi signali se je pojavila znatna razlika v izhodni fluorescenci med logično pravilnimi in nepravilnimi stanji [2].

Logična vrata IN-NE

Pri logičnih vratih IN-NE dobimo izhodni signal VKLOP le v primeru enega določenega vhodnega signala. Pri RNA-napravah je zato v primeru te logične operacije potrebno poleg sprožilne molekule RNA v sistem vpeljati tudi deaktivirajočo RNA, ki je komplementarna sprožilni RNA in bo s hibridizacijo preprečila vezavo sprožilne RNA na stikalo 'toehold'. Deaktivirajoča molekula RNA je zmožna, poleg vezave na prosto sprožilno RNA, tudi odstraniti že vezano sprožilno RNA s stikala, saj ima ta na 5'- in 3'-koncu podaljšani domeni, ki ne tvorita interakcij s stikalom in sta namenjeni tvorbi interakcij z deaktivirajočo RNA [2].

Pri izvedbi poskusa z logičnimi vrati IN-NE (tabela 3) so transkripcijo sprožilne RNA (vhodni signal A) inducirali z anhidrotetraciklinom (aTc), medtem ko so transkripcijo deaktivirajoče RNA (vhodni signal B) sprožili z IPTG [2].

Tabela 3: Pravilnostna tabela IN-NE.
signal A (aTc) signal B (IPTG) GFPmut3b-ASV
0
0
0
1
0
1
0
1
0
1
1
0


GFP fluorescenca je pokazala znatno razliko med logično pravilnim in nepravilnimi stanji [2].

Kompleksne logične operacije

V članku so prav tako sestavili kompleksnejša biološka vezja z RNA-napravami, ki so kombinirale logične operacije NE, IN ter ALI. Najkompleksnejše vezje, ki so ga konstruirali, je vsebovalo 12 vhodnih RNA signalov in je pri poskuskih in vivo delovalo robustno ter kazalo znatne razlike v fluorescenci med logično pravilnimi in nepravilnimi stanji. Ta računska operacija je bila:

(A1 IN A2 IN (NE A1*)) ALI (B1 IN B2 IN (NE B1*)) ALI (C1 IN C2) ALI (D1 IN D2) ALI (E1 IN E2),

kjer molekuli A1* in B1* predstavljata komplementarni zaporedji molekulama A1 in B1 [2].

Zaključek

Omenjeni poskusi nakazujejo na to, da lahko funkcionalno kompleksno biološko vezje tvorimo tudi z uporabo RNA-naprav. Te imajo pred klasičnimi biološkimi vezji, ki so osnovana na podlagi proteinskih regulatorjev, kar nekaj prednosti, med njimi predvsem visoko modularnost in nizek genetski odtis [2]. Biološka vezja z RNA-napravami imajo širok spekter možnih aplikacij, med drugim bi se lahko uporabljala v diagnostične namene za zaznavo različnih RNA molekul [4,5].

Literatura

[1] Cameron, D. E., Bashor, C. J. & Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nature Reviews Microbiology 12, 381–390 (2014).

[2] Green, A. A. et al. Complex cellular logic computation using ribocomputing devices. Nature 548, 117–121 (2017).

[3] Andersen, J. B. et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 64, 2240–2246 (1998).

[4] Pardee, K. et al. Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell 165, 1255–1266 (2016).

[5] Pardee, K. et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell 159, 940–954 (2014).

Personal tools