MESH - Razširljiv enkapsulinski sistem za uporabo v zdravstvu

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

MESH[1] je nagrajeni projekt študentske ekipe UCL iz Anglije na tekmovanju iGEM 2019.

Avtor povzetka: Vid Modic

Contents

Ideja

Idejo je študentska ekipa dobila zaradi potreb zdravsta po sistemih za dostavljanje zdravil, s katerimi bi lahko zmanjšali stranske učinke pri zdravljenju raka, kot je kemoterapija, in s tem povečali učinkovitost zdravljenja. Večina do sedaj razvitih dostavljalnih sistemov ima eno ali več pomanjkljivosti, kot so: toksičnost, imunogenost, nizka nosilnost zdravilnih učinkovin in sposobnost sprostitve nosilnega tovora ali visoki proizvodni stroški. Tekom raziskav dostavnih sistemov so odkrili bakterijske mikrokompartmente v katerih bakterije shranjujejo encime za lokalizacijo presnovnih reakcij. Navdihnjeni zaradi stabilnosti in vsestranskosti v njihovih aplikacijah so poskušali raziskati, kako lahko uporabijo takšne bakterijske razdelke za reševanje trenutnih težav z dostavnimi sistemi zdravil in ustvarijo takšen sistem na eleganten in učinkovit način. Zato so se odločili za razvoj sistema za dostavo zdravil, ki temelji na samodejno sestavljajočih se bakterijskih nanodelcih, imenovanih enkapsulini. Za funkcionalizacijo teh dostavnih veziklov so jih združili z Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins). V enkapsuline so vstavili citotoksično vsebino oziroma tovor, ki bo ob internalizaciji enkapsulina prekinila delovanje celic. Kot dokaz so sistem preizkusili na celicah raka dojke SK-BR-3, z DARPin929, ki se veže na pretirano izražene HER2 receptorje.

Lastnosti enkapsulinov

Enkapsulini, ki so jih uporabili za dostavni sistem, so iz bakterij Thermotoga maritima. Za razliko od drugih dostavnih načinov, kot so virusni delci, so enkapsulini pH odporni, termostabilni in neimunogeni. Glavni razlog, ki so ga navedli za izbiro enkapsulinov kot dostavnega sistema je njihova zmožnost samosestavljanja in-vivo in in-vitro.

DARPini

So proteini narejeni z tehnologijo genetskega inženirstva in imajo zelo visoko specifičnost do tarčnih proteinov. So oponaševalci monoklonskih protiteles, ki se lahko izrazijo v bakterijskih gostiteljih. Ko so pritrjeni na enkapsulin, DARPini olajšajo njihovo internalizacijo s selektivno endocitozo, ki jo posredujejo receptorji tarčnih celic[2].

Citotoksični tovor enkapsulinov

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili za uporabo fotosezibilnih proteinov miniSOG. Proteini miniSOG ob prisotnosti bele svetlobe sprožijo nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti in tako ubijejo tarčne celice. Z usmeritvijo svetlobe samo na območje tumorja lahko zagotovimo lokalizirano zdravljenje in tako zmanjšamo možne neželjene učinke na zdrave celice, s čimer zagotovimo večjo varnost pred trenutno dostopnimi načini zdravljenja.

Izboljšave obstoječih biokock

Enkapsuline iz Thermotoga maritima je uporabila že ekipa EPFL iz 2018 tekmovanja iGEM za razvoj proteinske kletke pri zdravljenju raka (BBa_K2686002). Njihova Biokocka ni vsebovala (BBa_K2686001) heksahistidinskega zaporedja, ki izboljša stabilnost enkapsulina pri višjih temperaturah. Zato je bilo potrebno eksperimentalno preveriti, če uporaba heksahistidinskega linkerja vstavljenega med ostankoma 43 in 44 (GGGGGGHHHHHHGGGGG), izboljša termično stabilnost proteinske kletke ter, če omogoča čiščenje proteinske kletke z uporabo postopka toplotnega čiščenja. Izkazalo se je, da z vstavitvijo heksahistidinskega zaporedja niso vplivali na termično stabilnost in tako s postopkom toplotnega čiščenja ni bilo mogoče izolirati čistih enkapsulinov. Zato so testirali izražanje obeh biokock v E. coli BL21(DE3) in ugotovili, da je nastanek enkapsulinov in-vivo oviran zaradi agregacije proteinskih monomerov pri različnih proizvodnjih temperaturah (37ºC in 18ºC). To je bilo razvidno iz SDS-PAGE analize topne, netopne in toplotno očiščene frakcije celičnega lizata, ker so bili monomeri enkapsulina skoncentrirani v netopni frakciji kljub temu da so temperaturo znižali iz 37ºC na 18ºC, ki je bolj ugodna za izražanje proteinov. Nato so z metodo dinamičnega sipanja svetlobe ugotovili, da sta obe biokocki izraženi in vivo ter sta nesposobni sestavlanja kletke zaradi nizke topnosti monomerov enkapsulina. Enkapsulinski monomeri T. martima se samosestavijo v kletke z premerom 20-24nm. Ampak pri tej velikosti ni bilo nobenega signala pri obeh temperaturah (37ºC and 18ºC). Zaznati pa je bilo le monomere (~ 1 nm premer) in agregate (> 100 nm). Tako so ugotovili, da monomeri, ki so kodirani z (BBa_K2686001) in BBa_K2686002 niso topni in vivo in ne morejo sestaviti kletke. Predvidevali so, da je problem v prisotnosti drugih bakterijskih proteinov, ki so tudi stabilni pri temperaturi čiščenja in bi se tako lahko izolirali skupaj z enkapsulini, kar jim posledično zmanjša topnost. Izkazalo se je, da to drži, ker so bili na SDS-PAGE prisotni tudi drugi proteini. Za odpravitev problema so se odločili za dodatno izboljšavo biokocke in zato dodali StrepII oznako (BBa_K3111103), ki bi omogočila izolacijo enkapsulinov z uporabo afinitetne kromatografije. Po namnoževanju izboljšanih delov z StrepII oznako (StrepII-tag) so izvedli SDS-page in opazili boljšo topnost proteinov. Vendar je bilo videti, da je proteinski konstrukt še vedno netopen pri 37ºC (A). Analizirali so topne frakcije z metodo dinamičnega sipanja svetlobe in opazili željene vrhove pri 20 nm, ki kažejo na prisotnost enkapsulinov. Analize vzorcev pripravljenih z izboljšano biokocko so potrdile, da so nastali enkasulini zmožni samosestavljanja in vivo.

Proizvodnja

Predhodne raziskave so pokazale, da se enkapsuline zlahka in upešno proizvaja v bakterijskih celicah, zato se je ekipa odločila za proizvodnjo enkapsulin-DARPin dostavnega sistema v E. coli BL21(DE3). Tekom eksperimentov so ves čas hkrati uporabljali tudi mezenhimske matične celice (MSC) kot kontolo, ker te ne vsebujejo receptorjev HER2 na katere se proteini DARPin specifično vežejo. Najprej so naredili konstrukt (BBa_K3111501), kateri vsebuje T. martima enkapsulin kodirajoče zaporedje s na C-terminalnem koncu fuzirano DARPin929 kodirajočo regijo. To napravo so sklonirali v pSB1C3 plazmid in po sekvenciranju vstavili v E. coli BL21(DE3). Da so preverili, če se je enkapsulin-DARPin fuziski protein uspešno izrazil, so izvedli SDS-page. Transformirane celice so lizirali z sonifikacijo in vzorce centrifugirali ter tako ločili topno in netopno frakcijo celičnega lizata. Nato so topno frakcijo očistili z kolonsko kromatografijo. Rezultat SPS-PAGE je pokazal prisotnost enkapsulinov s površinosko izraženimi proteini DARPin. Da so dosegli izražanje vsebine enkapsulina (miniSOG), so izkoristili kratek nativni C-terminalni tarčni peptid, ki omogoča nalaganje tovora v notranjost enkapsulinov. Na C-terminalni konec tarčnega peptida so fuzirali miniSOG preko fleksibilnega linkerja. Po transformaciji celic E. coli je sledila lizacija in analiza celičnega lizata z SDS- PAGE. Potrdili so prisotnost enkapsolin-DARPin hibridnega konstrukta (~50 kDa) in miniSOG (~15 kDa), saj so bile dobljene velikosti skladne s pričakovanimi. Ker miniSOG ne vsebuje Strep oznake, niso pričakovali prisotnosti razen, če je vezan v notranjost enkapsulina. Prav tako so prisotnost miniSOG dokazali z flourescenčno spektrometrijo, saj so zaznali flourescenco pri enkapsulinih, ki so imeli vezan miniSOG (BBa_K3111502)[3].

Poizkusi na sesalskih celicah

Celice raka dojke SK-BR-3 so inkubirali z enkapsulin-DARPin929-miniSOG (BBa_K3111502) dostavnim sistemom 30 minut in jih nato obsevali z belo svetlobo 30 minut pri 40 lumnov/cm2, da so aktivirali citotoksični efekt miniSOG. Celice so nato vizualizirali z flourescenčnim mikroskopom in opazovali internalizacijo enkapsulinov. Iz konfokalne mikroskopije je bila vidna flourescenca miniSOG po 1h inkubacije v obeh vzorcih, kar pa ni bilo pričakovano za vzorec MSC, ker se DARPini naj nebi vezali nespecifično. Prisotnost flourescence so pripisali previsoki koncentraciji konstrukta. Nato pa so celice obarvali z barvilom Annexin V-propidijev jodid, kar omogoča določanje celične smrti in izgubo celične viabilnosti z pretočno citometrijo. Vzporedno so delali tudi kontrolo na mezenhimskih matičnih celicah, ki nimajo HER2 receptorjev. Analiza celic z pretočno citometrijo je pokazala visok nivo apoptoze in 80% znižanje celične viabilnosti. Zaključek: Študentska ekipa je uspela dokazati, da njihov dostavni sistem (BBa_K3111503) uspešno targira tumorske celice, ki izražajo HER2 receptorje in jih ubije v večji meri kot mezenhimske matične celice. Dokazali so tudi, da imajo enkapsulin-DARPin dostavni sistemi visok potencial za uporabo pri zdravljenju rakavih obolenj in da jih je mogoče prilagoditi oziroma izboljšati z uporabo drugačnih enkapsulinov, proteinov DARPin in drugega citotoksičnega tovora oz. vsebine enkapsulina.


Zaključek

Študentska ekipa je uspela dokazati, da njihov dostavni sistem (BBa_K3111503) uspešno targira tumorske celice, ki izražajo HER2 receptorje in jih ubije v večji meri kot mezenhimske matične celice. Dokazali so tudi, da imajo enkapsulin-DARPin dostavni sistemi visok potencial za uporabo pri zdravljenju rakavih obolenj in da jih je mogoče prilagoditi oziroma izboljšati z uporabo drugačnih enkapsulinov, proteinov DARPin in drugega citotoksičnega tovora oz. vsebine enkapsulina.

Viri

  1. MESH. iGEM 2019 team UCL. https://2019.igem.org/Team:UCL.
  2. Plückthun, A.: Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015, 55, 489-511.
  3. Lagoutte, P., Mignon, C., Stadthagen, G., Potisopon, S., Donnat, S., Mast, J., Lugari, A., in Werle, B.: Simultaneous surface display and cargo loading of encapsulin nanocompartments and their use for rational vaccine design. Vaccine. 2018, 36, 3622-2638.
Personal tools