Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Izhodiščni članek: I. Cantone et al., “A Yeast Synthetic Network for In Vivo Assessment of Reverse-Engineering and Modeling Approaches,” Cell, 2009.


Sistemska biologija je disciplina, ki skuša kvantitativno opisati biološki sistem. Tak kvantitativen opis omogoča izdelavo matematičnega modela, z njim pa lahko napovemo obnašanje biološkega sistema po perturbaciji.[1][2][3][4][5]

Kvantitativen opis omogočajo nove tehnike in pristopi, npr. sekvenciranje nove generacije (NGS), masna spektrometrija (MS) in nuklearna magnetna resonanca (NMR) za analizo metabolitov in proteinov, kvantitativni PCR, DNA-mikromreže … Še posebej pa so pomembne metode, ki omogočajo izdelavo proteinskih in genetskih interakcijskih omrežij, npr. visokozmogljivi dvohibridni sistem kvasovke (Y2H[6]) in sintetični genetski nabor (SGA[7]).[1][3][8][9][10]

Z računskimi metodami, ki jih apliciramo na predpostavljeni model, lahko s prileganjem modelne funkcije sistemu določimo kvantitativne parametre. Od natančnosti dobljenih parametrov in ustrezno predpostavljene funkcije modela je nazadnje odvisna točnost napovedi obnašanja (fenotipa) biološkega sistema ob (genetski, okoljski) perturbaciji.[2][9]


Contents

Pristopi k sistemski biologiji

Modeliranje biološkega sistema zavisi od zastavljenega cilja in vrste biološke informacije, ki je na voljo.[3][11] Razvila sta se dva pristopa k reševanju problema:

  • Od spodaj navzgor (ang. bottom-up): gre za deduktiven pristop, ki temelji na natančnih kvantitativnih podatkih podsistema, ki ga preučujemo. Omogoča natančno mehanistično rekonstrukcijo podsistema, vendar ne upošteva njegovih interakcij s preostalim delom večjega biološkega sistema.[3][11]
  • Od zgoraj navzdol (ang. top-down): gre za induktiven pristop, ki temelji na velikem številu podatkov, pridobljenih z visokozmogljivimi (ang. high-troughput) metodami. Na ta način pridobimo veliko količino podatkov o komponentah in interakcijah vseh elementov sistema. Globalna slika, ki jo tako lahko sestavimo, pa je za posamezen podsistem manj natančna in izčrpna.[3][11]


Primer sistemskobiološkega pristopa od spodaj navzgor: Rekonstrukcija umetne mreže v kvasovki

Umetna mreža IRMA (In-vivo, Reverse-engineering and Modeling Assesment) je primer pristopa sistemske biologije od spodaj navzgor, ki zaradi natančnih kvantitativnih podatkov omogoča obratno inženirstvo, tj. poleg napovedi fenotipa tudi razmerja med elementi takega umetnega podsistema. [5] IRMA sestoji iz 5 ločenih transkripcijskih enot na genomu kvasovke Saccharomyces cerevisiae:

  • gen CBF1 (s 3' GFP), ki ga regulira promotor HO,
  • gen GAL4, ki ga regulira promotor MET16,
  • gen SWI5 (s 3' MCY9), ki ga regulira promotor GAL10,
  • gen GAL80 (s 3' 3xFLAG), ki ga regulira promotor ASH1,
  • gen ASH1 (s 3' 2xHA), ki ga regulira promotor ASH1.[5]

Kljub temu, da gre za sicer majhen podsistem, pa vsebuje vse značilnosti večjega sistema, saj obstaja med elementi več interakcij:

  • Cbf1 je transkripcijski faktor promotorja MET16 in aktivira transkripcijo GAL4,
  • Gal4 je transkripcijski faktor promotorja GAL10 in aktivira transkripcijo SWI5,
  • Swi5 je transkripcijski faktor promotorja ASH1 in HO, zato aktivira transkripcijo GAL80, ASH1 in CBF1,
  • Ash1 je represor promotorja HO in zavira transkripcijo CBF1.[5]

Sistem IRMA ima tudi stikalo, saj prisotnost galaktoze spodbudi transkripcijo z galaktoznega promotorja, posledično pa tudi aktivacijo vseh ostalih elementov. Takrat proteina Gal4 in Gal80 nista v interakciji. Na gojišču z glukozo je IRMA izključena, saj protein Gal80 asociira z Gal4 in preprečuje, da bi aktiviral transkripcijo s promotorja GAL10.[5]


Analiza modela IRMA

Z merjenjem koncentracije genov IRME (CBF1, GAL4, SWI5, GAL80, ASH1) oz. njihovo mRNA s qPCR ob različnih perturbacijah je mogoče pridobiti vrednosti potrebnih parametrov za matematični opis modela.[5]

Spremljanje dinamike modela pri različnih virih ogljika

Koncentracija mRNA je odvisna časovno in od vira ogljika: glukoza sistem ugasne, galaktoza pa prižge. Na glukozi najprej opazimo visoko porast Gal4 in Gal80, ki naj bi se aktivirala zaradi menjave gojišča, ne pa aktivacije glukoze same. Značilni so 3 vrhovi v aktivaciji Swi5, saj ima 3 tarče (CBF1, GAL80, ASH1). Cbf1 se zaradi promotorja HO aktivira z zamikom – sekvenčno po vezavi Swi5. Analogno se Cbf1 z zamikom utiša ob menjavi gojišča z glukozo za galaktozo.[5]

Koncentracija mRNA v stacionarnem stanju ob prekomernem izražanju genov IRME

Povečana ekspresija aktivatorjev (CBF1, GAL4, SWI5) poveča ekspresijo vseh genov v obeh medijih (z višjo ravnjo v galaktozi, ko je Gal80 neaktiven). Povečana ekspresija CBF1 povzroči močno povišano raven SWI5, vendar se raven GAL4, ki je tarča Cbf1, in regulator SWI5, le malo poviša. Razlog je v tem, da je protein Gal4 stabilen, zato le majhno povečanje mRNA v galaktozi inducira promotor GAL10, ki regulira SWI5. Povečanje ekspresije GAL80 povzroči utišanje ostalih genov, saj se veže in inaktivira Gal4, tudi v prisotnosti galaktoze.[5]


Modeliranje IRME

Da bi lahko napovedali odziv sistema po perturbaciji, je potrebno matematično opisati njegov model in določiti vrednosti parametrov, ki ta model opisujejo. Časovno ekspresijo vsakega elementa IRME lahko opišemo z diferencialno enačbo; model tako sestoji iz sistema nelinearnih diferencialnih enačb. Dobimo izraz za transkripcijsko aktivnost gena kot funkcijo ostalih genov in perturbacije. Privzamemo, da koncentracija genov oz. njihova transkripcija sledi Hillovi kinetiki, hkrati pa je proporcionalna koncentraciji pripadajočega proteina. Razgradnja proteinov sledi kinetiki reakcije 1. reda.[5] Parametri, ki nastopajo v enačbah, so:

  • bazalna aktivnost, tj. imanentno prisotna koncentracija mRNA,
  • največja hitrost transkripcije gena,
  • Hillov koeficient,
  • koncentracije mRNA proteinov, ki vplivajo na transkripcijo drugih genov,
  • hitrosti razgradnje proteina,
  • na GAL80 vpliva tudi zakasnitev delovanja promotorja CBF1,
  • aktivacija SWI5 z Gal4 je inhibirana z Gal80 po Michaelis-Mentenini kinetiki proporcionalno z Gal80 in inverzno z afinitetno konstanto
  • vpliv medija (glukoza ali galaktoza).[5]

Cilj izvedenih eksperimentov je določitev vseh 33 parametrov, ki nastopajo v sistemu nelinearnih diferencialnih enačb, ki opisujejo model. 16 izmed 33 parametrov dobimo s poskusi merjenja moči promotorjev v stacionarnem stanju pri različni ravni izražanja transkripcijskega faktorja. Parametre moči promotorjev dobimo s prileganjem modelne funkcije stacionarnega stanja. Preostale parametre dobimo iz poskusov obnašanja sistema v stacionarnem ali dinamičnem stanju po menjavi medija. Simulacije modela zelo dobro opišejo eksperimentalne podatke.[5]


Obratno inženirstvo

Cilj obratnega inženirstva je poleg kvantitativnih parametrov tudi določiti razmerja med elementi sistema.[12] Te lahko izračunamo z dvema pristopoma:

  • z uporabo diferencialnih enačb opišemo časovno odvisnost mRNA kot posledico dinamike genskega omrežja, regresorje - tj. interaktorje izbranega gena, pa iščemo kot najboljšo rešitev enačbe po perturbaciji,
  • z uporabo Bayesovega teorema grafično opišemo verjetnost interakcij oz. razmerij med spremenljivkami.

Značilno je uporaba Bayesovega pristopa zanesljivejša in primernejša na večjih modelih. Arhitekturo IRME bolje opiše pristop z diferencialnimi enačbami.[5]


Od sistemske biologije k sintezni

Razlog študije modelov je (največkrat) izgradnja celičnih tovarn. Zanje je ključno poznavanje metabolizma (mikro)organizma, ki bi ga – z ustreznimi genetskimi modifikacijami – izrabili za pridobivanje želenih metabolitov.[2][3][4][10][12][13][14][15] Opisan primer IRMA dobro popiše delovanje soodvisnih elementov podsistema kvasovke, vendar je za metabolno inženirstvo potrebno poznavanje veliko večjega sistema elementov. Ker izgradnja celične tovarne zahteva načrtovanje metabolnih poti, moramo kvantitativno poznati vsaj reakcije centralnega ogljikovega metabolizma. Pri tem je neobhodno potreben tudi pristop od zgoraj navzdol, ki vključuje visokozmogljive metode določanja interakcijskih omrežij in metabolomike.[3][4][6][7][10][12][16]


Metabolni model

Metabolni model ne popisuje družno vseh elementov organizma, temveč le ključne elemente metabolizma, ki so pomembni v celičnem inženirstvu pri načrtovanju proizvodnje želenih učinkovin. Tak model torej upošteva reakcije (osrednjega) ogljikovega metabolizma, hitrost teh reakcij oz. encimsko kinetiko, kompartmentalizacijo procesov, termodinamsko naravo reakcij (redoks potencial, pH, koncentracija molekul, kemijsko ravnotežje), fluks, izrabo vira ogljika, prisotnost proteinov (poleg encimov) in njihove interakcije, regulacijo posameznih stopenj: od regulacije izražanja genov do regulacije encimov z metaboliti.[11][15]. Tak metabolni model z upoštevanjem vrednosti parametrov lahko napove rast, produkcijo in fluks po perturbaciji.[3][4][12][14][15]


Načrtovanje celičnih tovarn

Cilj metabolnega inženirstva je izboljšanje že obstoječih metabolnih poti za učinkovitejšo proizvodnjo že prisotnih metabolitov, oz. uvedba novih metabolnih poti za proizvodnjo heterolognih učinkovin.[2][3][4][10][12][16] V obeh primerih lahko do neuspeha pride zaradi:

  • slabe rasti mikroorganizma zaradi pomanjkanja metabolitov, ker se preusmerijo v proizvodnjo želene molekule,
  • nastanka toksičnih intermediatov,
  • uhajanja potrebnih intermediatov,
  • zaloge kofaktorjev in prekurzorjev
  • interakcije z gostiteljevimi encimi in metabolnimi potmi,
  • neaktivnosti heterolognih encimov,
  • predolge metabolne poti, ki pomeni manjši izkoristek,
  • neustrezne kompartmentalizacije.[11][12]

Metabolni model omogoča racionalen dizajn metabolnih omrežij, saj je z njimi mogoče simulirati fluks in njegovo uravnavanje zaradi uravnavanja izražanja genov s kombinacijami promotorjev, transkripcijskih faktorjev, aktivatorjev in represorjev. Možno je napovedati tudi rast takšne celične tovarne, družno pa kompartmentalizacija in uravnavano izražanje zmanjšata toksičnost intermediatov in morebitnih končnih produktov.[2][11][12]

Primer metabolnega inženirstva: izboljšanje proizvodnje etanola pri kvasovki

Da bi izboljšali proizvodnjo etanola, je potrebno spremeniti regulacijo centralnega ogljikovega metabolizma.[3][16] Težava je, da je fluks preko osrednjega ogljikovega metabolizma zelo natančno kontroliran: Etanol nastaja med anaerobno fermentacijo, hkrati pa tudi glicerol in biomasa. Fluks bi bilo potrebno preusmeriti iz glicerola in biomase v etanol.[16] Predpostavljene tarče za izboljšanje proizvodnje etanola so:

  1. zamenjava reakcij z NADPH pri rasti biomase za NADH,
  2. zamenjava reakcij z NAD+ pri rasti biomase za NADP+,
  3. uvedba reakcije, ki pretvarja NADH v NADPH,
  4. zamenjava reakcij sinteze glicerola za etanol, pri čemer pa pride do oksidacije NADH.[16]

Preko simulacij metabolnega modela, ki ima dostop tudi do reakcij, ki sicer v kvasovki ne potekajo, je možno pridobiti podatke o uspešnosti predpostavljenih rešitev. Kot najugodnejša rešitev je bila zmodelirana 4.; potrdili so jo tudi eksperimentalno in za 10 % povečali izkoristek proizvodnje etanola. Pri tem je uvedba heterologne gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (nefosforilajoča in od NADP+ odvisna) omogoča ireverzibilno oksidacijo gliceraldehid-3-fosfata in NADP+ v 3-fosfoglicerat in NADPH. Na ta način je raven oksido-redukcijskih kofaktorjev ugodnejša za nastanek etanola.[16]


De novo sinteza organizmov

Za uspešno izgradnjo celičnih tovarn je ključno sodelovanje sistemske in sintezne biologije.[1][12][13] Za napovedovanje novih kompleksnih sistemov bo potrebno opisati kompleksnejše modele. To pa bo mogoče le ob poznavanju vseh – tudi kinetičnih – parametrov večjega števila različnih mikroorganizmov. Visokozmogljive metode pa so pri tem ključnega pomena.[4][8][9] Ker je za kvasovko Saccharomyces cerevisiae poznanih več modelov, je zelo dober biotehnološki organizem. Raziskovalci predvidevajo, da jim bo uspelo de novo – s sintezo posameznih komponent sestaviti funkcionalen kvasni genom z želenimi lastnostmi in brez odvečnih regij.[4]


Viri

  1. 1.0 1.1 1.2 A. R. Borneman, P. J. Chambers, and I. S. Pretorius, “Yeast systems biology: modelling the winemaker’s art,” Trends in Biotechnology, vol. 25, no. 8, pp. 349–355, 2007.
  2. 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 R. Mustacchi, S. Hohmann, and J. Nielsen, “Yeast systems biology to unravel the network of life,” Yeast. 2006.
  3. 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 D. Petranovic and G. N. Vemuri, “Impact of yeast systems biology on industrial biotechnology,” Journal of Biotechnology, 2009.
  4. 4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 R. S. K. Walker and I. S. Pretorius, “Applications of yeast synthetic biology geared towards the production of biopharmaceuticals,” Genes. 2018.
  5. 5.00 5.01 5.02 5.03 5.04 5.05 5.06 5.07 5.08 5.09 5.10 5.11 I. Cantone et al., “A Yeast Synthetic Network for In Vivo Assessment of Reverse-Engineering and Modeling Approaches,” Cell, 2009.
  6. 6.0 6.1 N. Yachie et al., “Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics,” Molecular Systems Biology, 2016.
  7. 7.0 7.1 A. H. Y. Tong and C. Boone, “Synthetic Genetic Array Analysis in Saccharomyces cerevisiae,” in Yeast Protocols, 2006.
  8. 8.0 8.1 C. Boone, “Yeast systems biology: Our best shot at modeling a cell,” Genetics, 2014.
  9. 9.0 9.1 9.2 V. Janjić, R. Sharan, and N. Pržulj, “Modelling the yeast interactome,” Scientific Reports, 2014.
  10. 10.0 10.1 10.2 10.3 B. Oud, A. J. A. Van Maris, J. M. Daran, and J. T. Pronk, “Genome-wide analytical approaches for reverse metabolic engineering of industrially relevant phenotypes in yeast,” FEMS Yeast Research. 2012.
  11. 11.0 11.1 11.2 11.3 11.4 11.5 K. C. Soh, L. Miskovic, and V. Hatzimanikatis, “From network models to network responses: Integration of thermodynamic and kinetic properties of yeast genome-scale metabolic networks,” FEMS Yeast Research. 2012.
  12. 12.0 12.1 12.2 12.3 12.4 12.5 12.6 12.7 H. Lopes and I. Rocha, “Genome-scale modeling of yeast: chronology, applications and critical perspectives,” FEMS yeast research. 2017.
  13. 13.0 13.1 C. M. Denby et al., “Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer,” Nature Communications, 2018.
  14. 14.0 14.1 B. D. Heavner and N. D. Price, “Comparative Analysis of Yeast Metabolic Network Models Highlights Progress, Opportunities for Metabolic Reconstruction,” PLoS Computational Biology, 2015.
  15. 15.0 15.1 15.2 B. J. Sánchez, C. Zhang, A. Nilsson, P. Lahtvee, E. J. Kerkhoven, and J. Nielsen, “Improving the phenotype predictions of a yeast genome‐scale metabolic model by incorporating enzymatic constraints,” Molecular Systems Biology, 2017.
  16. 16.0 16.1 16.2 16.3 16.4 16.5 C. Bro, B. Regenberg, J. Förster, and J. Nielsen, “In silico aided metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for improved bioethanol production,” Metabolic Engineering, 2006.
Personal tools