Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Povzeto po članku: D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens et al: Designing P. aeruginosa synthetic phages with reduced genomes. Sci. Rep. 2021, 11(1), str. 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2

Contents

Uvod

Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni za človeka potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki bi ohranil sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

Pseudomonas aeruginosa je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2, 3].

Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija

V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo P. aeruginosa PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je pridobljen fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov P. aeruginosa. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

Priprava rekombinantnih bakteriofagov

Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk S. cerevisiae BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in z njo transformirali bakterijo P. aeruginosa PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov

Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije P. aeruginosa, in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov P. aeruginosa, medtem ko sta faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp37 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z in vivo in in vitro poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V in vitro eksperimentu so v bakterijsko kulturo P. aeruginosa v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic P. aeruginosa v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri in vivo eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja G. mellonella, ki so jih okužili s P. aeruginosa tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije P. aeruginosa [1].

Zaključek

Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okužbe bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije P. aeruginosa v in vivo in in vitro študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

Viri in literatura

  1. D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing P. aeruginosa synthetic phages with reduced genomes. Sci. Rep., 2021, 11, str. 1–10.
  2. Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. Biotechnology Advances, 2019, 37, str. 177–192.
  3. CDC, HAI: Pseudomonas aeruginosa Infection. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (citirano 23. 4. 2021).
  4. P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.
Personal tools