Optogenetski nadzor bioprodukcije beta-karotena v kvasovkah na številnih laboratorijskih skalah
Uvod in povzetek dela
V članku so raziskovali uporabo optogenetike, orodja za nadzor genskih vezij v tovarnah mikrobnih celic z uporabo svetlobe, za nadzor bioprodukcije beta-karotena v Saccharomyces cerevisiae. Raziskovalci so izdelali štiri različne osvetljevalne naprave s posebnimi značilnostmi ter ocenili optogenetsko aktivacijo in proizvodnjo beta-karotena med napravami. Nato so združili optogenetsko indukcijo in proizvodnjo beta-karotena, da bi ustvarili sev, ki proizvaja beta-karoten, inducibilno s svetlobo. Študija kaže, da osvetlitev, volumen kulture in mešanje različno vplivajo na optogenetsko aktivacijo in proizvodnjo beta karotena v različnih napravah. Raziskovalci predlagajo, da je optimizacija obeh komponent sistema ključnega pomena, preden ju združimo v optogenetske seve, ki proizvajajo beta-karoten, da se izogne obsežnemu odpravljanju težav. Rezultati študije lahko pomagajo pri načrtovanju sevov in naprav za večje sisteme v industrijskih okoljih. [1]
Beta-karoten
Beta-karoten je trpen znan po svoji rumeno/oranžni barvi. Spada v skupino spojin imenovanih karotenoidi, ki so odgovorni za živahne barve rastlin. Najdemo ga v različnem sadju, zelenjavi in mikroorganizmih. Veliko beta-karotena se nahaja v korenju, sladkem krompirju, špinači in ohrovtu. Beta-karoten Je visoko konjugirana molekula, kar pomeni, da ima izmenjujoče se dvojne in enojne vezi, ki prispevajo k njeni barvi in stabilnosti. Je netopen v vodi, lahko pa se topi v maščobah in oljih. Je bistveno hranilo, ki ga dobimo s prehrano in predhodnik vitamina A, kar pomeni, da ga lahko telo po potrebi pretvori v vitamin A. Sadje in zelenjava sta glavni prehranski vir beta-karotena. Znan je po svojih antioksidativnih lastnostih, ki pomagajo zaščititi celice pred poškodbami, ki jih povzročajo škodljivi prosti radikali. Kot predhodnik vitamina A ima ključno vlogo pri ohranjanju zdravega vida, podpiranju imunskega delovanja in spodbujanju pravilne rasti in razvoja. Poleg svojega prehranskega pomena ima beta-karoten različne industrijske uporabe. Široko se uporablja v industriji hrane in pijač kot naravno barvilo za živila. Živahna oranžna barva beta-karotena izboljša vizualno privlačnost živil in nadomešča sintetična barvila. Uporablja se tudi v kozmetični industriji kot sestavina izdelkov za nego kože, predvsem zaradi svojih antioksidativnih in zaščitnih lastnosti kože. Beta-karoten se lahko proizvaja s kemično sintezo, ekstrakcijo iz rastlin ali bioproizvodnjo z uporabo mikroorganizmov. Mikrobna bioprodukcija vključuje inženiring kvasovk ali bakterij za proizvodnjo beta-karotena z uvedbo in optimizacijo genov, vključenih v njegovo biosintetično pot. Z Optogenetiko lahko nadzorujemo in povečamo proizvodnjo beta-karotena v tovarnah mikrobnih celic z uporabo svetlobno občutljivih proteinov. [1]
Optogenetika
Optogenetika je metoda, ki omogoča nadzor in manipulacijo specifičnih celic v živih organizmih s pomočjo svetlobe. Ta tehnika vključuje uporabo genskega inženiringa za vnos svetlobno občutljivih proteinov, imenovanih opsini, v celice. Ko se ti opsini izrazijo v celicah, jih je mogoče aktivirati ali zavirati s svetlobo določene valovne dolžine. Najpogostejši optogenetski postopek vključuje uporabo virusnega vektorja za vnos genov, ki kodirajo želene opsine, v specifične celice. Vektor se vbrizga v ciljno tkivo in celice prevzamejo gene, kar jim omogoči, da proizvedejo opsine. Ko se na celice osvetli svetloba ustrezne valovne dolžine, se opsini aktivirajo ali zavirajo, kar povzroči spremembe v obnašanju celic. Na primer, če se uporabljajo opsini, ki stimulirajo celice, bo svetleča svetloba povzročila, da celice sprožijo akcijske potenciale. Mehanizem za optogenetiko temelji na dejstvu, da so opsini ionski kanali, ki omogočajo pretok ionov čez celično membrano, ko jih aktivira svetloba. Ta ionski tok spremeni električni potencial skozi membrano, kar povzroči spremembe v obnašanju celic.Spojina, na katero vpliva optogenetika, je sam protein opsin. Ko svetloba z ustrezno valovno dolžino obsije opsine, so ti podvrženi konformacijski spremembi, ki omogoča pretok ionov skozi njih, kar vodi do sprememb v obnašanju celic. [1], [2]
Optične naprave
Prva naprava imenovana OptoBox, lahko osvetli 1 ml kulture v plošči s 24 vdolbinicami z uporabo dveh LED diod na vdolbinico, ki ju je mogoče programirati in zagotavljata 0-4 mW/cm2 svetlobe. Druga naprava, imenovana OptoTube, lahko osvetli 3 ml kulture v 14 ml epruvetah z uporabo LED diod, ki lahko zagotovijo 0-12 mW/cm2 svetlobe in jo je mogoče programirati z Arduino. Tretja naprava, imenovana kulturna platforma eVOLVER, je prilagojena iz prejšnje študije in omogoča nadzor temperature, mešanja in osvetlitve (prek dodatne stranske LED diode, ki zagotavlja 6 mW/cm2 svetlobe) za 16 enot, od katerih vsaka vsebuje stekleno vialo, kjer je mogoče spremljati hitrost rasti in proizvodnjo betakarotena. Četrta naprava, imenovana OptoFlasks, ima po meri izdelana stojala za osvetljevanje, ki lahko držijo različno število LED diod (vsaka zagotavlja 12 mW/cm2 svetlobe), na vrhu katerih je mogoče hraniti 25-50 ml kultur bodisi v vdolbini/s pregradami ali v bučke z ravnim dnom. [1]
Konstrukcija sevov
Sev OPTO-EXP: Optogenetski sev GFP OPTO-EXP, ki služi kot začetni sev, je bil pridobljen iz prejšnje študije (Zhao et al., 2018). Ta sev je bil izpeljan iz ozadja CEN.PK2-1C in spremenjen tako, da vključuje pPGK1-EL222 (konstitutivni izraz svetlobno aktiviranega transkripcijskega faktorja) in pC120-GFP (optogenetski promotor, na katerega se veže EL222 za aktiviranje transkripcije GFP) pri Δhis3 lokus. Konstitutivna proizvodnja beta-karotena: Za konstitutivno proizvodnjo beta-karotena so bili genetski konstrukti narejeni z uporabo materiala DNA iz študije Rabeharindranta et al. (2019). Razvit in uporabljen je bil trifuzijski encim CrtYBekI, ki sodeluje pri biosintezi betakarotena. Plazmida pHR0016 in pMRI34 sta bila modificirana za optimizacijo izražanja genov z zamenjavo promotorjev s pTDH3 oziroma pPGK1-pTDH3. Trifuzijski gen CrtYBekI je bil vstavljen v ho lokus v sevu CEN.PK2-1C z uporabo urejanja genoma CRISPR-Cas9. Optogenetski nadzor proizvodnje beta-karotena: Da bi dosegli optogenetski nadzor proizvodnje beta-karotena, je bil osnovni sev OPTO-EXP-mCherry (yPH_463). Namesto GFP je bil uporabljen reporter mCherry, da bi preprečili spektralno prekrivanje pri mikroskopiji. Trifuzijski gen CrtYBekI je bil postavljen pod nadzor optogenetskega promotorja pC120 v plazmidu pHR0016. Trifuzija CrtYBekI je bila vstavljena na ho lokus v sevu OPTOEXP-mCherry in razčlenjena s CRISPR. Poleg tega so bili geni CrtE in tHMG vstavljeni pod konstitutivne promotorje pPGK1 oziroma pTDH3 na lokusu dpp1. [1]
Rezultati
V študiji so uporabili sev kvasovk, ki vsebuje svetlobno aktiviran transkripcijski faktor pod konstitutivno ekspresijo, in izmerili ekspresijo fluorescenčnega proteina za transkripcijskim faktorjem, da bi ocenili optogenetsko aktivacijo. Da bi določili najboljše pogoje za optogenetsko aktivacijo, so raziskovalci izvedli eksperiment s časovnim potekom, pri čemer so vsako uro s citometrijo merili ravni GFP. Ugotovili so, da je bila najvišja aktivacija na celico dosežena 6 ur po inokulaciji, in standardizirali optogenetske poskuse z uporabo teh parametrov. Kot reference so izmerili nivoje fluorescence GFP, izražene iz močnih in srednjih konstitutivnih promotorjev. [1]
Študija je pokazala, da je optogenetska aktivacija v napravah dosegla povprečno največ 13 % promotorja pTDH3. Ocene količine svetlobe na mililiter kulture so pokazale, da med 1 in 4 mW/cm2/mL zadošča za največjo aktivacijo v različnih napravah. Vendar pa razlike med napravami kažejo, da na optogenetsko aktivacijo poleg količine svetlobe vplivajo tudi drugi dejavniki. Porazdelitev svetlobe je bila aktivno preučevana z uporabo modelov enodelnih in dinamičnih modelov tekočine za optimizacijo osvetlitve fotobioreaktorjev (večinoma kultur fotosintetskih mikroorganizmov) in mikrobna optogenetika bi lahko dejansko imela koristi od takih pristopov. [1]
Ugotovili so tudi, da parametri volumna in mešanja močno vplivajo na optogenetsko aktivacijo v minibioreaktorski napravi eVOLVER. Zmanjšanje prostornine in povečanje mešanja je izboljšalo aktivacijo, medtem ko je pomanjkanje mešanja povzročilo zmanjšanje aktivacije. Učinki volumna in mešanja so lahko povezani s količino prejete svetlobe na celico in izmenjavo plinov v mediju. [1]
Proizvodnja beta-karotena je bila občutljiva na količino kulture in mešanje. Raziskovalci menijo, da izboljšana izmenjava plinov spodbuja proizvodnjo beta-karotena z vplivom na celični metabolizem. Ker je znano, da je beta-karoten občutljiv na svetlobo, je študija testirala tudi vpliv modre svetlobe (461 nm), ki se uporablja za optogenetsko aktivacijo v konstitutivnem sevu, ki proizvaja beta-karoten. Raziskovalci so ugotovili, da je svetloba samo v napravah OptoBox in eVOLVER povzročila približno 20-odstotno zmanjšanje proizvodnje beta-karotena. [1]
Zaključek
Aktivacija optogenetskih sistemov se lahko razlikuje glede na uporabljene naprave in manjše razlike v pogojih gojenja lahko pomembno vplivajo na proizvodno obnašanje seva. Z neodvisno optimizacijo teh komponent je mogoče identificirati in odpraviti potencialne nezdružljivosti in moteče dejavnike. Medtem ko se optogenetski sistemi in osvetljevalne naprave izboljšujejo, je uporaba optogenetike za nadzor mikrobnih sistemov in bioprodukcije še vedno v zgodnjih fazah. Razširljivost ostaja tehnični izziv in ta študija se osredotoča na razvojni proces v laboratoriju. Vendar pa postavlja temelje za nadaljnje korake, vključno s testiranjem v majhnih in večjih bioreaktorjih, preden se stvari izvajajo na industrijski ravni. [1]
Viri
[1] S. Pouzet, J. Cruz-Ramon, M. Le Bec, C. Cordier, A. Banderas, S. Barral, S. Castano-Cerezo, T. Lautier, G. Truan in P. Hersen: Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Front. Bioeng. Biotechnol. 2023, 11, 1085268
[2] Optogenetics. https://en.wikipedia.org/wiki/Optogenetics (pridobljeno 22. 5. 2023)
