Phage display

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

UVOD

Rak na jajčnikih je eden izmed najbolj smrtnih ginekoliških rakov pri ženskah, zato predstavlja hudo nevarnost. Kljub izboljšavi zdravljenja z agresivnimi operacijami, obsevanjem in kemoterapijo, je učinkovitost pri zmanjševanju smrtnih žrtev zaradi raka na jajčniku nezadostna, kar void k razvitju novih pristopov, kot ‘z ligandi usmerjeno zdravljenje’, ki temelji na prepoznavi tumorskih zametkov in uspešni dostavi zdravil na tumorsko mesto, zatorej je uspešnost zdravljenja večja in stranski učinki manjši. Huang in sodelavci so z uporabo fagne predstavitvene knjižnice iskali primerne peptidne ligande za bolj uspešno zdravljenje raka na jajčnikih v mišjih modelih z rakastimi ksenografti.

MATERIALI, METODE IN REZULTATI

In vivo izpiranje (selekcija) fagne knjižnice

Za odkritje peptidnih ligandov, ki bi bili primerni za zdravljenje raka jajčnikov, je bilo potrebno izdelati mišji model z rakastimi ksenografti: suspenzijo celic SKOV3 (človeške epitelijske celice raka jajčnikov) so subkutano injicirali v miši z zavrtim imunskim sistemom. Nato so v miši, ki so razvile tumorsko tkivo, intravenozno injicirali fagno predstavitveno knjižnico. Za to so uporabili komercialno dostopno knjižnico: Ph.D.™-12 Phage Display Peptide Library Kit, ki je fagna predstavitvena knjižnica, kjer fagi na površini izražajo naključne 12-merne peptide, le-ti pa so preko 4-peptidnega liganda (Gly-Gly-Gly-Ser) vezani na N-terminus pIII faga M13. Kasneje so tumorsko tkivo pobrali iz mišjega modela, homogenizirali in obdelali tako, da so pridobili fage, ki so se zbrali znotraj tumorskega tkiva. Le-te so nato pomnožili in dobljen produkt znova vbrizgali v mišji model (še dvakrat) – tehnika izpiranja (‘biopanning’). Na koncu so kandidatnim fagnim klonom s sekveniranjem določili DNA zaporedje. Po treh izpiranjih se je dobljeni fagni ‘bazen’ (vezan na tumorsko tkivo) povečal. Ugotovili so, da se je peptid WSGPGVWGASVK na fagu PC3-1 močno pomnožil, iz česar lahko sklepamo na specifičnost peptida za rakave celice raka na jajčnikih. Peptid WSGPGVWGASVK, izražen na PC3-1, ustrezen kandidat za označevalca rakavih celic pri raku na jajčnikih.


In vitro identifikacija fagnih klonov

Za hitro oceno vezave fagnega klona so uporabili metodo ELISA: fagni klon, ki se je najmočneje vezal na rakaste celice raka na jajčnikih, je bil PC3-1.

Sintetizirani peptidi so bili uporabljeni v raziskavi kompetitivnega vezanja. Peptid WSGPGVWGASVK je povzročil zmanjšano vezavo PC3-1 na SKOV3 rakaste celice, medtem ko pri dodatku kontrolnih peptidov vezava PC3-1 ni bila ovirana. To namiguje na selektivnost faga PC3-1 zaradi izraženega peptida WSGPGVWGASVK. Po odstranitvi površinskih proteinov celic (po obdelavi s tripsinom) so ugotovitvili, da se PC3-1 lahko veže na SKOV3 celice tudi pod grobimi proteolitskimi pogoji.

Analiza vezave peptida

Za imunofluorescenčne študije so uporabili celice SKOV3 ter HUVEC celice (človeške celice popkovne vene), vzgojene na krovnem stekelcu. Celice so nato inkubirali s sintetiziranimi peptidi , ki so bili označeni z biotinom ter vezavo peptidov na celice prikazali z dodatkom kompleksa avidin-FITC, kar so nato opazovali pod laserskim mikroskopom. Na podlagi fluorescenčnih rezultatov so potrdili vezavo in internalizacijo peptida WSGPGVWGASVK v SKOV3 in aktiviranih HUVEC celicah, skupaj z rezultati imunohistoloških in vivo preiskav. Nato so s pretočno citometrijo odkrili , da se količina vezavnega peptida WSGPGVWGASVK na SKOV3 celice sorazmerno povečuje s koncentracijo samega peptida.

Raziskave adhezije celic

SKOV3 suspenzije v mediju brez vsebnosti seruma z in brez dodatka izbranega peptida so bile posejane v vdolbinice mikrotiterske plošče, ki so bile predhodno prekrite s fibronektinom ali kolagenom I. Po obdelavi rezultatov so ugotovili, da peptid WSGPGVWGASVK za 30% zmanjša povezavo SKOV3 celice na fibronektin. Inhibirana je tudi vezava celice na kolagen I. Omenjen peptid torej inhibira povezavo celic z ostalimi zunajceličnimi elementi, kar ovira normalno celično delovanje.

ZAKLJUČEK

Odkrivanje peptidnih ligandov, ki funkcionalno in specifično naselijo tumorske celice, predstavlja novo priložnost za diagnozo raka ter njegovo uspešnejše zdravljenje. Potencialni peptidni ligandi so identificirani s pomočjo fagnih predstavitvenih knjižnic. V raziskavi, na kateri temelji izbran članek, so s pomočjo mišjih modelov s ksenografti odkrili 12-merni peptid WSGPGVWGASVK, ki naseli rakave celice endotelijskega raka jajčnikov. Glavni dosežek, do katerega so prišli s pomočjo izražanja peptidov na fagni površini, je zelo pomemben, saj peptid WSGPGVWGASVK predstavlja močen potencial za klinično korist pri dostavljanju zdravil v samo središče rakavih celic pri obolenju z rakom na jajčnikih.

ČLANEK: Ma C, Yin G, Yan D, He X, Zhang L, Wei Y, Huang Z; ‘A novel peptide specifically targeting ovarian cancer identified by in vivo phage display’; Journal of Peptide Science. 2013 Sep 17; DOI: 10.1002/psc.2555.

Personal tools