Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Kolaps replikacijskih vilic je proces, pri katerem pride do ločitve krakov replikacijskih vilic zaradi dvoverižnega preloma DNA. Nekatere raziskave nakazujejo, da do kolapsa replikacijskih vilic pride v do 50 % primerov transkipcije pri bakterijah.

V osnovi lahko popravljanje kolapsa replikacijskih vilic razdelimo v 5 faz:

  • Formacija 3'-OH repa
  • Vrinjenje DNA verige
  • Migracija vej
  • Reševanje Hollidayevega križišča in ligacija
  • Sestavljanje primosoma, ki obnovi replikacijo in obnovitev kompleksa replikacijskih vilic

Celoten potek popravljanja kolapsa replikacijskih vilic v shemi.

Contents

Uvod

Vse skupaj se začne, ko se v matrični verigi DNA pojavi zareza. Zareze se lahko pojavijo med sintezo in popravljanjem DNA, zaradi UV žarkov ali oksidacijskega stresa. V seminarju bova obravnavala primer, ko se zareza pojavi na vodilni verigi DNA, a potrebno se je zavedati, da lahko do kolapsa in popravljanja le-tega pride tudi na zaostajajoči verigi DNA. Princip popravljanja je podoben opisanemu.
Na položaju zareze pride do terminacije transkripcije, saj DNA polimeraza nima na voljo matrične verige. Posledica tega je dvoverižni prelom DNA, zaradi katerega matrična vodilna veriga in novonastala veriga oddisocirata od drugega kraka replikacijskih vilic. Okazakijevi fragmenti, ki nastajajo na zaostajajoči verigi, se povežejo z matrično vodilno verigo s pomočjo DNA-ligaze (shema).
Transkripcija se nadaljuje, ko celice obnovijo kompleks replikacijskih vilic s homologno rekombinacijo. V seminarju se bova osredotočila na potek tega procesa v E.coli.

Formacija 3'-OH repa

Ko pride do kolapsa replikacijskih vilic, se na topi konec oddisocirane dvojne verige veže kompleks encimov RecBCD. Ta kompleks je velik 330 kDa in je sestavljen iz treh proteinov, RecB, RecC in RecD. RecB in RecD sta helikazi, odvisni od ATP. Rec B potuje po eni verigi v smeri 3' -> 5', RecD pa po komplementarni verigi v smeri 5' -> 3'. Hitrost potovanja obeh encimov po verigi ni enaka, saj je na začetku procesa RecD hitrejša in vodilna helikaza. Domena podenote RecB, ki je v kompleks povezana z 30 aminokislin dolgim fleksibilnim linkerjem, ima tudi eksonukleazno aktivnost, saj lahko z obeh verig odceplja nukleotide. Na začetku preferenčno hidrolizira nukleotide na enojni verigi s 3'-koncem, sicer se odcepljanje nukleotidov dogaja na obeh verigah. Podenota RecC predstavlja vez med obema helikazama, ki regulira njuno hitrost potovanja po verigah in povečuje njuno procesivnost.

Hitrost potovanja in mesto odcepljanja nukleotidov se spremenita, ko podenota RecC naleti na mesto chi. Gre za specifično zaporedje 5'-GCTGGTGG-3', ki se nahaja v genomu približno 1000-krat oziroma na vsakih 5000 baznih parov. Med posameznimi bakterijskimi vrstami se chi sekvence razlikujejo. Ko podenota RecC doseže mesto chi in se veže nanj, pride do konformacijske spremembe celotnega kompleksa, zaradi katere postane podenota RecB hitrejša od RecD. Prav tako se spremeni konformacija eksonukleaze, ki začne hidolizirati izključno nukleotide na enojni verigi s 5'-koncem. To privede do nastanka enoverižnega 3'-OH repa, saj se enojna veriga s 3'-koncem ne krajša več, medtem ko se degradacija enojne verige s 5'-koncem nadaljuje. Domneva se, da na verigi z enoverižnim 3'-koncem nastaja zanka, kamor se kasneje vežejo RecA proteini. Tvorba zanke naj bi bila razlog za preprečitev poškodb na kompleksu RecBCD, kjer se nadaljuje degradacija le 5'-verige (shema).

Enoverižno DNA, ki nastane, hipno obdajo proteini SSB (proteini, ki se vežejo na enoverižno DNA) in nastalo enojno verigo stabilizirajo ter ji spremenijo sekundarno strukturo. Na DNA je še vedno vezan kompleks RecBCD, ki po formaciji 3'-OH konca aktivno pomaga pri nalaganju RecA proteinskih enot na 3'-konec novonastale enojne verige. RecA proteini so 38 kDa veliki monomeri, ki so ključni za potek homologne rekombinacije. Na enoverižno DNA se ob pomoči RecBCD naložijo v obliki heliksa in skupaj z DNA tvorijo nukleoproteinski filament. Stabilna vezava na DNA je mogoča le v primeru, da imajo v strukturo vezan tudi ATP. Prva faza vezave monomerov RecA na DNA je nukleacija. Gre za vezavo prvih nekaj enot RecA. V tej fazi lahko proces ovirajo proteini SSB, ki so vezani na DNA, a hkrati lahko proces tudi olajšajo, ker se RecA lažje vežejo na ssDNA s spremenjeno sekundarno strukturo. Ob vezavi RecA se proteini SSB odcepijo z DNA. Ko je jedro heliksa ustvarjeno, se začne faza podaljševanja v smeri 5' -> 3'. V tej fazi vezava monomernih enot poteka hitreje, prav tako proteini SSB ne predstavljajo več ovir. Ko je celoten 3'-rep obdan z RecA proteini, je formacija 3'-OH repa zaključena (shema).

Vrinjenje DNA verige

Sledi faza vrinjenja DNA verige. Nukleoproteinski filament, obdan z RecA proteini, v celici išče dvojno vijačnico DNA s homologno sekvenco. Ko se homologni verigi srečata, proteini RecA delujejo kot rekombinaze in ob hidrolizi ATP katalizirajo vrinjenje enoverižne DNA v dvojno vijačnico. RecA brez vezanega ATP ima manjšo afiniteto za vezavo na DNA kot RecA z ATP, zato ob hidrolizi ATP pride do disociacije proteina RecA z DNA, ki prav tako poteka v smeri 5' -> 3'. Vrinjena veriga nadomesti tisti del verige v DNA dupleksu z identičnim zaporedjem, odrinjena veriga pa tvori izpodrinjeno zanko ali D-zanko (shema).

Migracija vej

3'-konec, ki je sedaj pritrjen in vrinjen v homologni del donorske DNA, sproži fazo, imenovano migracija vej. V tem koraku se donorska DNA veriga začne odpirati (daljša se odrinjena veriga) in se homologno povezuje s 5'-koncem vrinjenega inserta ter insert na ta način podaljšuje. Pomembno je poudariti, da se ob tem začne odpirati tudi dvojna vijačnica krajše verige, ki je napadla donorsko. 5'-konec komplementarne verige vrinjeni molekuli DNA se začne povezovati z odrinjeno verigo donorske DNA. V sredini, med krajšo in donorsko DNA, nastane križišče enoverižnih DNA molekul, ki migrira oz. se pomika v obratni smeri, kot je sprva potekala replikacija. Križišču enoverižnih DNA vijačnic, ki se preoblikuje tako, da tvori odprto, neprekrižano konformacijo enoverižnih molekul rečemo Hollidayevo križišče. Slednje je značilno za homologne rekombinacije.
Migracija Hollidayevega križišča je lahko spontana, a v takšnem primeru poteka zelo počasi. V bakterijah proces katalizira encimski kompleks imenovan RuvAB, ki je sestavljen iz encimov RuvA in RuvB. Oba encima sodelujeta pri genski rekombinaciji v E. coli in v njenih popravljalnih mehanizmih, ki vključujejo rekombinacijo.
Po oblikovanju odprte konformacije Hollidayevega križišča, se zdaj vanj veže oktamerni encim RuvA tako, da po dve njegovi podenoti držita vsako izmed štirih dvoverižnih DNA vej v križišču. Vejo dvoverižne DNA, ki je sestavljena iz donorske enoverižne DNA in enoverižne DNA molekule, ki je donorsko napadla, zaradi preglednosti imenujmo mešana DNA veriga. Na proteinski podenoti RuvA, ki mešano DNA verigo obdajata, se veže protein RuvB in nastane kompleks RuvAB. RuvB je heksamerni encim, ki ima obliko obroča.
Ker iz Hollidayevega križišča izhajata dve mešani verigi DNA, se na RuvA tudi vežeta dva RuvB encimska obroča. Vežeta se tako, da se pritrdita na podenoti RuvA proteina in objameta omenjeni mešani verigi. Ruv B imata ATP-azno aktivnost in delujeta kot DNA črpalka, tako da verigi, ki jih objemata, vlečeta ven iz Hollidayevega križišča, verigi, ki v križišče vstopata, pa se zato krajšata. Na tak način poteka migracija vej, mešani verigi pa se podaljšujeta. (shema (a))

Reševanje Hollidayevega križišča in ligacija

Ko migracija teče nekaj časa, se v sredini Hollidayevega križišča, na dveh vzporednih enoverižnih DNA molekulah, pojavi značilen simetričen nukleotidni zapis. Ta zapis zazna encim RuvC, ki ima endonukleazno aktivnost. Encimom RuvC pravimo tudi resolvaze, saj se cepitev enoverižnih, vzporednih DNA molekul v Hollidayevem križišču imenuje resolucija. Resolvaza RuvC nato cepi dve enoverižni molekuli DNA tako, da nastaneta dva presledka. Pred cepitvijo se bile vse štiri dvoverižne molekule DNA v križišču med seboj povezane, zdaj pa so z enoverižno DNA molekulo povezane le po dve med seboj. Kot posledica cepitve se nato aktivira DNA-ligaza, ki razcepljeni enoverižni DNA molekuli poveže tako, da v križišču nastaneta dve ločeni dvojni vijačnici (shema (b)). Izven križišča se vsaki izmed njih komplementarna veriga konča, enoverižni deli pa se povezujejo v enotno dvojno vijačnico. Opazimo lahko, da se kot rezultat resolucije in ligacije struktura replikacijskih vilic obnovi.

Sestavljanje primosoma, ki obnovi replikacijo in obnovitev kompleksa replikacijskih vilic

V zadnjem koraku se mora v strukturi replikacijskih vilic sestaviti še kompleks, ki bo podvojil DNA molekulo do konca. Pomembno je razumeti, da se replisom ne more sestaviti, saj je za iniciacijo potrebno mesto Ori, napake v DNA in kolaps replikacijskih vilic pa se lahko zgodi kjerkoli na molekuli DNA.
V tem primeru ima celica razvite mehanizme, ki omogočijo sestavljanje kompleksa za nadaljnje podvojevanje, pri tem pa sodeluje večje število proteinov. Najprej protein PriA (lahko tudi PriB, PriC in DnaT) interagira z proteinom DnaC, ki omogoči vezavo DnaB helikaze na mesto replikacijskih vilic. Encim PriA je zelo podoben encimu DnaA, le da DnaA omogoča vezavo DnaB helikaze le na mestih OriC. V nadaljevanju DnaG primaza oblikuje oligonukleotidne začetnike, v kompleks pa se veže tudi DNA polimeraza. Celoten novosestavljeni kompleks za nadaljnjo podvojevanje DNA se imenuje primosom, ki obnovi replikacijo (replication restart primosome).
Zanimivo je, da je opisani sistem obnove replikacijskih vilic zelo natančen, saj se mutacije ali spremembe DNA med samim procesom popravljanja načeloma ne pojavljajo. Poleg mehanizma obnove replikacijskih vilic z rekombinacijo poznamo tudi nekatere druge sisteme, ki ne uporabljajo principa replikacije, vendar pa so v bakterijah redkeje prisotni.

Viri

  • B.E. Tropp: Principles of Molecular Biology, 1. izdaja. Burlington: Jones & Bartlett Learning, 2014.
  • Nelson & Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 6. izdaja. New York: W. H. Freeman, 2013.
  • Smith G.R.: How RecBCD enzyme and chi promote DNA break repair adn recombination: a molecular biologist's view. Microbiology and Molecular Biology reviews. 2012. 76(2): 217-228.
  • Yeeles J.T.P. & Dillingham M.S.: The processing of double-stranded DNA breaks for recombinational repair by helicase-nuclease complexes. DNA Repair. 2010. 9(3): 276-285.
  • McGlynn P. & Lloyd R.G.: Recombinational repair and restart of damaged replication forks. Nature Reviews: Molecular cell biology. 2002. 3(11): 859-870.

Personal tools