Povečana razgradnja biomase in večji izkoristek etanola z izražanjem mutirane monolignol 4-O-metiltransferaze v lesu rastlin rodu Populus

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Enhancing digestibility and ethanol yield of Populus wood via expression of an engineered monolignol 4-O-methyltransferase

Les je eden izmed najpomembnejših organskih materialov na svetu. Poleg tega, da je bil v zgodovini vodilni vir pridobivanja energije, se na široko uporablja tudi npr. kot gradbeni material ali pri proizvodnji papirja in izdelavi pohištva. V zadnjem času pa dobiva vse večji pomen kot vir enostavnih sladkorjev, ki služijo za pridobivanje biogoriv in nekaterih industrijsko pomembnih bioloških produktov.

Contents

Zgradba in lastnosti lesa

Les je sekundarni ksilem, ki je zgrajen iz osrednje lamele in iz več plasti sekundarne celične stene, sestavljenih iz celuloze (40-50 %) ter hemiceluloze (25-30 %). Olesenele rastline prepoznamo predvsem po nalaganju lignina v celični steni. Molekule lignina tvorijo mrežasto strukturo in delujejo kot vezivo, ki varuje celulozo in hemicelulozo pred razgradnjo. Rastlini daje dodatno trdnost in ji omogoči stabilnost ter rast v višino. Naloga lignina je prav tako ustvariti hidrofobno bariero, s čimer prepreči dostop encimom, da razgradijo polisaharide do enostavnejših sladkorjev.

Sinteza lignina

Lignini so kompleksne in heterogene polimerne makromolekule zgrajene iz 4-hidroksifenilpropanoidnih enot. Gradniki teh enot so monolignoli, in sicer p-kumaril, koniferil in sinapil alkoholi. Sinteza lignina poteče po šikimatni poti iz glukoze s pomočjo različnih encimov. Glavni encim, ki sodeluje pri sintezi ligninskih prekurzorjev je fenilalanin amonijak liaza (PAL). Sama sinteza vključuje nastanek radikalskih intermediatov iz prekurzorjev, ki reagirajo med seboj ali z že nastajajočim polimerom. Zaradi neusmerjene reakcije radikalov je struktura lignina razvejana.

Metode in rezultati

Glavni problem pri pretvorbi rastlinske biomase do enostavnih sladkorjev je lignin. Znanstveniki so želeli pripraviti rastline z manjšo količino lignina v celični steni, ne da bi pri tem vplivali na rast rastline. Ugotovili so, da metilacija 4-hidroksi skupine na monolignolu prepreči njegov nastanek. Z naključno mutagenezo, t.i. iterativno saturacijsko mutagenezo (ang. iterative saturation mutagenesis), so pripravili variante encima O-metiltransferaze, ki katalizira 4-O-metilacijo monolignolov (MOMT). Najučinkovitejšo katalizo je imela mutanta MOMT4. Ekspresijsko kaseto gena MOMT4 so z Agrobacterium vnesli v hitro rastočo hibridno trepetliko (Populus tremula x Populus alba) pod kontrolo promotorja gena za fenilalanin amonijak liazo-2 (PAL2) iz graha. Drevesa, ki so proizvajala mutiran encim, so imela manjšo količino lignina v celični steni. Po dveh mesecih so v listih transgenih rastlin na podlagi retencijskih časov in UV spektrov zaznali dva metabolita, 4-O-metiliran koniferil alkohol in 4-O-metiliran sinapil alkohol. Prisotnost teh dveh metabolitov dokazuje pravilno delovanje mutiranega encima MOMT4.

Dodatne analize z 2D NMR eksperimenti so pokazale povečano tvorbo prečnih povezav med polimeri, kar je privedlo do kondenzacije lignina. Po encimski razgradnji lesa s tako spremenjeno strukturo lignina se je količina sproščenih enostavnih sladkorjev povečala za 62 %. Pri rastlinah z mutiranim MOMT4 so med drugim opazili tudi zmanjšanje količin fenolnih spojin, kot so hidroksicinamati in hidroksibenzoati. Ti se vežejo s polisaharidi in ligninom preko estrskih vezi in lahko igrajo vlogo pri spreminjanju okidacijskega potenciala monolignolov. V celici se najprej povežejo s sinapil alkoholom, nato pa se vgradijo v ligninski polimer.

Pri slikanju vzorcev lesa z IR so še ugotovili, da povečano izražanje MOMT4 vpliva na sintezo in ultrastrukturo celuloznih vlaken v celični steni, ki so glavni vir fermentirajočih sladkorjev. Istočasno s spremembami sestave lignina in strukture MOMT4 so namreč opazili, da se je vsebnost celotne celuloze povečala za polovico, povečala pa se je tudi količina kristalinične celuloze. Pomembno je, da kljub spremembam v sestavi in strukturi lignina ter celuloze ni prišlo do sprememb v razvoju in rasti oz. v procesu nastajanja rastlinske biomase.

Zaključki

Proizvodnja biogoriv in drugih biološko pomembnih produktov zahteva sproščanje enostavnih sladkorjev iz lesne biomase. Glavni korak k izboljšanju razgradljivosti celične stene in večjih izkoristkov biogoriv (predvsem etanola) je zmanjšanje količine lignina in/ali spreminjanje njegove strukture s pomočjo spreminjanja genov, vključenih v biosintezno pot monolignolov. Večina postopkov, s katerimi se odstranjuje lignin je neučinkovitih in dragih. Z izražanjem MOMT4 v hibridni trepetliki pa so znanstveniki dosegli do 62 % večje izločanje enostavnih sladkorjev in več kot 40 % večji izkoristek etanola, brez vpliva na rast in razvoj transgenih rastlin.

MBT seminarji 2017.

Personal tools