Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih
Uvod
V zadnjem času je zanimanje za uporabo cianobakterij za bioproizvodnjo koristnih spojin iz trajnostnih virov, kot so svetloba, CO2, odpadna voda, močno naraslo. Cianobakterije predstavljajo potencial v bioproizvodnji zaradi zmožnosti predelave izhodiščnih virov v polimere, pigmente in biogoriva. Poleg tega ponujajo izrazite prednosti pred rastlinami in zelenimi algami, ker so učinkovitejše pri zajemanju sončne energije in rastejo hitreje kot višje rastline, ter so bolj dovzetne za gensko manipulacijo kot alge (1,2). Poleg uporabe cianobakterij kot monoproizvajalcev, se v zadnjem času veča tudi želja po uporabi le-teh v ti. konzorcijih s ko-kultiviranimi heterotropnimi vrstami. Sem spadajo bakterije, kot so Escherichia coli, Bacillus subtilis in kvasovke. V konzorcijih fotosintetske cianobakterije proizvedejo sekrecijske molekule, ki jih heterotrofne vrste uporabljajo za rast in hkrati vzajemno pomagajo pri rasti cianobakterij z lastnimi produkti metabolizma. Vendar ustvarjanje konzorcijev predstavlja velik izziv in zahteva razvoj novih genetskih vezij in inženirskih vložkov za vzpostavitev koordiniranih procesov, ki konzorciju kot celoti omogočajo preživetje (1).
Signalni procesi za znotrajcelično koordinacijo
V naravnih mikrobnih združbah se kolektivno obnašanje vzpostavi in ohranja preko signalnih procesov, ki jih imenujemo quorum sensing (QS) oziroma sistemi za zaznavanje celične gostote. Ti procesi zajemajo produkcijo, sekrecijo in akumulacijo signalnih molekul, imenovanih avtoinduktorji, ki ob vezavi na receptorje sprožajo povečano produkcijo same molekule po principu pozitivne povratne zanke. Večina QS procesov deluje preko acil-homoserin laktonov (AHL), ki pri po Gramu negativnih bakterijah vplivajo na različne procese (patogenost, razvoj biofilma, kompetenco in druge) (3). Velikokrat bakterije kombinirajo signale različnih tipov avtoinduktorjev za sinhrotrono znotraj- in medvrstno komunikacijo. Biološka vezja v sintezni biologiji za programiranje obnašanj na nivojih populacije so ustvarjena na podlagi teh naravnih procesov in razviti so že dobro okarakterizirani genetski deli za produkcijo in detekcijo AHL.
V nadaljnje opisana študija je bila zasnovana z namenom testiranja potencialno uspešne svetlobno vodene bioprodukcije preko medvrstne komunikacije s pomočjo QS molekul. Okarakteritirana je bila funkcionalnost treh dobro opisanih sistemov za zaznavanje celične gostote Lux, Las in Tra v Synechoccus elongatus. Za opazovanje medvrstne koordinacije je bila signalna pot AHL razdeljena med dva organizma. E. coli je predstavljala pošiljatelja zaradi vstavljenih genov za sintezo AHL, S. elongatus pa prejemnika preko izraženih genov za detekcijo signalnih molekul, ki so bili vstavljeni pod IPTG-inducibilni trc promotor. Opazovanje ekspresije v odvisnosti od koncentracij AHL je bilo izvedeno z vstavljenim vstavljen gen za reporterski protein mNG pod ustrezen promotor v S. elongatus. Dodatno sta bila S. elongatus pod promotor AHL vstavljena gena cscB in sps, ki regulirata sekrecijo sukroze v rastni medij, s čimer je bila pokazana potencialna uporaba genetskega vezja na podlagi AHL za bioproizvodnjo. Fluorescenca je bila pri vseh eksperimentih merjena s pretočno citometrijo (1).
AHL molekule v QS
AHL so majhne in relativno hidrofobne molekule, ki uspešno difundirajo skozi biološke membrane in so zato bolj pogosto uporabljene v genetskih vezjih. AHL, kot so 3OC6-HSL, 3OC8-HSL in 3OC12-HSL, sintetizirajo encimi LuxI, TraI in LasI. Mehanizem aktivacije teh molekul poteče preko vezave molekule na hidrofobni žep N-terminalnega dela transkripcijskega aktivatorja – LuxR za 3OC6-HSL, TraR za 3OC8-HSL in LasR za 3OC12-HSL – kar prepreči preko pravilnega zvitja domene njeno proteolitično razgradnjo. Sistem LuxI/LuxR je bil prvi odkriti sistem za zaznavanje celične gostote in je v sintezni biologiji eden najpomemnejših sistemov (4). Najdemo ga pri bakteriji Vibrio fischeri, ki s pomočjo omenjenega sistema ob določeni celični gostoti zaradi izražanga gena za luciferazo, fluorescira. TraR receptor pri QS sistemu bakterije Agrobacterium tumefaciens, ki preko vezave na signalno molekulo veže na promotorje na plazmidu Ti in aktivira transkripcijo konjugacijskih genov za prenos Ti plazmida v okuženo rastlino (5). LasR receptor izhaja iz bakterije Pseudomonas aureginosa in je transkripcijski aktivator velikega števila genov, med drugim genov za virulenco (6).
Eksogena dostava AHL v S. elongatus
Rezultati so pokazali, da sta pri cianobakterijah z dodanim zapisom za LuxR fluorescenca in občutljivost za signalno molekulo pozitivno korelirala z naraščajočo koncentracijo 3OC6-HSL. Razmerje mNG ekspresije pri maksimalni koncentraciji AHL je bilo 8x višje od ekspresije v odsotnosti AHL. Višanje koncentracije dodanega IPTG je vplivalo na boljšo občutljivost pri nižjih koncentracijah dodanega AHL (1). Pri S. elongatus z zapisom za TraR ekspresija reporterskega proteina ni močno narasla z višanjem dodanega 3OC8-HSL in se je povečala za le ca. 50% pri najvišji koncentraciji dodanega AHL v primerjavi z ekspresijo brez dodanega induktorja. Občutljivost se prav tako ni povečala pri višanju koncentracije induktorja TraR (1). Vezje, ki je baziralo na LasR, je pokazalo večji dinamični rang odziva glede na naraščajočo koncentracijo dodanega AHL (3OC12-HSL). Opaziti je bilo moč nižjo ekspresijo reporterja v odvisnosti AHL in boljšo občutljivost sistema. Tu je pri višanju koncentracije IPTG bila opažena negativna korelacija z rangom indukcije in sicer je prišlo do oslabljenega fitnesa cianobakterij pri višji koncentraciji izraženega LasR (1).
Eksogena dostava AHL v E.coli
V nadaljevanju je bilo raziskovano, ali so opažene lastnosti od AhL-odvisnih vezij vrstno-specifične za cianobakterije. Zato so bili isti elementi izraženi v E. coli. Pri ekspresiji gena luxR pod IPTG-inducibilnim promotorjem trc je bilo opaženo podobno obnašanje kot pri S. elongatus glede na občutljivost, magnitudo indukcije in opaženo fluorescenco. Povečane koncentracije IPTG so prav tako povečale občutljivost reporterja. Razlika je bila pri fluorescenci brez dodanega induktorja, ki je bila pri E. coli mnogo nižja. Rezultati pri vezju TraR vnešenem v E.coli so prav tako sovpadali z rezultati pri S. elongatus. Tudi v tem primeru je bil bazalni nivo ekspresije v E. coli mnogo nižji. Pri reporterskem vezju LasR v E. coli so opažanja spet sovpadala z rezultati, pridobljeni pri cianobakteriji. Tu je bil opažen hud defekt v rasti pri visokih koncentracijah induktorja IPTG, kar nakazuje na citotoksičnost akumulacije LasR proteina v obeh vrstah (1).
Medcelična koordinacija v mešani kulturi
Za opazovanje komunikacije med E.coli in S. elongatus so bile konstruirane E.coli celice, ki so kodirale za eno od AHL sintaz in celice S. elongatus z zapisom za odgovarjajoče transkripcijske aktivatorje. Indukcijski rang biosintetičnih AHL molekul, pridobljenih iz E.coli je bil eksperimentalno določen za vse tri receptorske konstrukte. Rezultati so pokazali močno korelacijo med supernatantom z vsebujočimi AHL iz pošiljatelja in nivojem mNG indukcije vseh treh prejemniških sistemov Lux. Tudi odvisnost občutljivosti od dodanega IPTG je korelirala z rezultati, pridobljenimi pri eksogeni dostavi AHL prejemniškim celicam. Ti rezultati nakazujejo na to, da lahko AHL, ki jih sintetizira pošiljateljski sev, inducira od odmerka odvisen odziv v prejemniških sevih (1).
Seva sta bila nato gojena v kokulturi in analiza odvzetih vzorcev po 48 urah gojenja je potrdila medcelično komunikacijo. Lux pošiljateljski sev je generiral močan odgovor v odvisnem prejemniku in sicer je bila fluorescenca za 20% močnejša v primerjavi z eksogeno dodanim 3OC6-HSL, bazalni level ekspresije mNG se je povečal za 2x. Tudi kokultura z LasI pošiljateljskim sevom je pokazala močno ekspresijo mNG1. Izveden je bil še dodaten eksperiment, kjer so z uporabo Lux konstrukta, vstavljenega v S. elongatus regulirali ekspresijo sukroze. Pod PluxI promotor so v bakterijo vstavili gena cscB in sps, ki kodirata za sukrozno permeazo (cscB) in sukrozno fosfatno sintazo (sps). Cianobakterija je uspešno sintetizirala sukrozo kot odziv na AHL, pridobljen v kokulturi iz E.coli kot tudi z eksogeno dodanim AHL. Pri tem je bila produkcija uspešnejša pri eksogeni dostavi signalne molekule, predvideno zaradi slabše dostopnega ogljika, ki bi podpiral rast E.coli (1).
Zaključek
V večini genomov cianobakterij do sedaj ni bilo najdenih homologov LuxI/LuxR družine in cianobakterije ne uporabljajo signalnih poti na podlagi AHL ali podobnih sistemov za zaznavanje celične gostote. Vseeno so AHL večkrat bili opaženi kot ekstracelularni metaboliti v mikrobnih združbah, kjer prevladujejo cianobakterije in ti signali so v študijah dokazano vplivali na njihove karakteristike. V kolikor bi cianobakterije reprogramirali tako, da bi lahko poleg izločanja AHL le-te tudi zaznavale, bi to vodilo v izdelavo naprednejših konstruktov za zaznavanje celične gostote. Druge aplikacije QS konstruktov cianobakterij bi bile v industrijske namene uporabne tako pri akseničnih kulturah kot tudi kokulturah za bioprodukcijo v zgodnjih in kasnejših fazah rasti celic, odvisno od željenih ciljev. S tem bi lahko na primer občutno zmanjšali stroške tekom industrijskih aplikacij, ki vključujejo bakterije za sintezo bioproduktov.
V študiji so pokazali, da je možna izdelava genetskih konstruktov na osnovi sistemov za zaznavanje celične gostote v mešanih konzorcijih cianobakterij s heterotrofi, kar predstavlja velik korak k razvijanju svetlobno usmerjene in trajnostne bioproizvodnje preko signaliziranja in usklajevanja mikrobnih vrst.
Viri
1. Kokarakis, E. J., Rillema, R., Ducat, D. C. & Sakkos, J. K. Developing cyanobacterial quorum sensing toolkits: towards interspecies coordination in mixed autotroph/heterotroph communities. bioRxiv 2022.07.20.500858 (2022) doi:10.1101/2022.07.20.500858.
2. Knoot, C. J., Ungerer, J., Wangikar, P. P. & Pakrasi, H. B. Cyanobacteria: Promising biocatalysts for sustainable chemical production. Journal of Biological Chemistry 293, 5044–5052 (2018).
3. Miller, M. B. & Bassler, B. L. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol 55, 165–199 (2001). 4. Fuqua, W. C., Winans, S. C. & Greenberg, E. P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. J Bacteriol 176, 269–275 (1994).
5. Costa, E. D., Chai, Y. & Winans, S. C. The quorum-sensing protein TraR of Agrobacterium tumefaciens is susceptible to intrinsic and TraM-mediated proteolytic instability. Mol Microbiol 84, 807–815 (2012).
6. Kiratisin, P., Tucker, K. D. & Passador, L. LasR, a Transcriptional Activator of Pseudomonas aeruginosa Virulence Genes, Functions as a Multimer. J Bacteriol 184, 4912 (2002).
