Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Spatiotemporal control of gene expression with pulse-generating networks

(Elizabeta Jevnikar)

Contents

Uvod

Za mnoge biokemijske procese v celici so značilni prehodni odzivi na dolgo trajajoče spremembe v okolju. Ti odzivi imajo lahko zelo različne časovne okvirje (od milisekund do več ur) in se pojavljajo tudi v različnih prostorskih dimenzijah. Primere lahko najdemo v posameznih celicah ali v večceličnih organizmih in zajemajo s somitogenezo povezano izražanje genov med razvojem embrija, JAK/STAT poti imunskega odziva, cirkaidane ritme itd. Impulzno obnašanje je v naravi pogosto in pomembno, vendar pa ga mnogokrat ne znamo popolnoma razložiti. V proučevanem članku so avtorji predstavili sintezni bakterijski (E. coli z elementi iz V. fischeri) sistem, ki sestoji iz celic, ki pošiljajo signale ter prejemniških celic. Signalizacijske celice sintetizirajo induktor acilhomoserinlakton (AHL), ki difundira do prejemniških celic, ki so prostorsko blizu. Vezje za generiranje impulza prejemniških celic vključuje motiv usmerjene zanke (angl. feedforward motif), ki se na dražljaj (AHL) odzove tako, da najprej pride do aktivacije (prehodno izražanje) in kasneje do posledične represije izražanja GFP.

Uporabljeni plazmidi

Plazmid v celicah za pošiljanje signalov pLuxI-Tet8 vključuje zapis za AHL sintetazo (LuxI), ki je pod kontrolo promotorja PLtetO-1. Prejemniške celice vsebujejo dva plazmida - pLTSUB-202 in pPSSUB-101 oz. njune različice. Plazmid pLTSUB-202 vsebuje zapis za CI(LVA), ki je manj stabilna verzija CI represorja iz bakteriofaga λ in je pod kontrolo luxPR. CI(LVA) so destabilizirali z 12 aminokislinskih ostankov dolgo oznako. Ta plazmid omogoča tudi konstitutivno izražanje LuxR iz V. fischeri pod kontrolo luxPL promotorja, vsebuje pa še marker za odpornost proti kanamicinu ter p15A mesto za začetek podvojevanja. Različici pLTSUB-202-RBSD in pLTSUB-202-RBSH se od osnovnega plazmida razlikujeta v RBS mestu, lociranem zgoraj od cI kodirajoče regije. Posledica je v manjši učinkovitosti translacije (RBS II za cI v pLTSUB-202 je močnejše kot RBS D, le-to pa je močnejše od RBS H). Plazmid pPSSUB-101 vsebuje marker za rezistenco proti kloramfenikolu ter ColE1 mesto za začetek podvojevanja. Vsebuje tudi zapis za manj stabilno obliko GFP, GFP(LVA), ki je pod kontrolo hibridnega promotorja luxPRcI-OR1. Le-ta je sestavljen iz divjega tipa luxPR promotorja s CI OR1 operatorskim mestom. Za različico tega plazmida pPSSUB-101-mut4 je značilna mutacija ene baze, C -> A (4. baza OR1), katere posledica je zmanjšana afiniteta represorja za operator.

Pridobitev eksperimentalnih podatkov

Za eksperimente je bil uporabljen sev E. coli DH5α. Z ustreznimi plazmidi transformirane celice so bile gojene pri 37 °C v M9 minimalnem mediju z dodatkom kazamino kislin, tiamina, CaCl2, ustreznih antibiotikov ter induktorjev. Za eksperimente v tekočem stanju so izražanje inducirali v zgodnji log fazi z dodatkom AHL ustrezne koncentracije. Vsakih 5 minut je bil vzorec volumna 1 ml odvzet in takoj analiziran z metodo ločevanja fluorescenčno označenih celic (angl. fluorescence-activated cell sorting, FACS). Kulture so ohranjali pri OD600 gostotah med 0.1 in 0.3 s ponavljajočimi redčitvami. Za eksperiment v trdni fazi je bila uporabljena metoda snemanja s časovno mikroskopijo (angl. time lapse microscopy). Kultura prejemniških celic je bila gojena do OD600 0.1 v M9 tekočem mediju, 4-krat koncentrirana in enakomerno porazdeljena na M9 agar rezino. Kultura signalizacijskih celic je bila gojena istočasno do OD600 1.0 v M9 tekočem mediju, koncentrirana 20-krat ter nanešena v posameznih kapljicah na isto rezino. Temperatura vzorcev je bila ves čas 37 °C. Mikroskopske in fluorescentne slike so bile zajete na različnih razdaljah od celic pošiljalk vsake 4 minute. Za simulacijo obnašanja sistema sta bila s programsko opremo MATLAB ustvarjena dva modela.

Osnovni princip

Za sproženje komunikacije se mora v signalizacijskih celicah izraziti LuxI sintetaza, ki katalizira nastanek AHL. Le-ta nato prosto difundira iz signalizacijskih celic do prejemniških celic. Transkripcija CI in GFP v prejemniških celicah se začne, ko se LuxR-AHL dimer veže na lux mesto luxPR promotorja. Ko se CI nakopiči v zadostni koncentraciji, se veže na operatorsko mesto hibridnega promotorja (ki kontrolira GFP) in inhibira nadaljnje nastajanje GFP. Pred indukcijo je bazalni nivo GFP ekspresije nizek. Po indukciji se nivo GFP najprej dvigne, potem pa pade ter ustali na nizki vrednosti (ta je lahko višja ali nižja od začetne).

Konstruiranje knjižnice vezij

Glavne značilnosti impulza so čas naraščanja, čas padanja, širina, amplituda ter povečanje (angl. gain). Avtorji so proučili učinek translacijske učinkovitosti CI ter afinitete vezave represorja ter operatorja na povečanje pulza. Če sta učinkovitost translacije CI ter afiniteta vezave operatorja visoki, se vsebnost GFP ne poviša. V tem primeru (tudi brez AHL) bazalna ekspresija CI popolnoma zavira luxPRcI-OR1 promotor. Nizka učinkovitost translacije CI ter nizka afiniteta vezave represorja imata za posledico visoko izražanje GFP (kot odziv na AHL) in nato posledično manjšo represijo. Ta analiza je bila temelj za konstruiranje knjižnice vezij za generiranje impulzov s kombinacijami različnih učinkovitosti CI translacije ter vezave represorja. Vezje z najmočnejšim RBS mestom ter originalnim CI OR1 ni dalo opaznega odziva. Ko pa so skombinirali najšibkejše RBS mesto ter OR1 z mutacijo ene baze, so dosegli impulz z visoko fluorescenco ter podaljšanim trajanjem.

Regeneracija impulza

Avtorje je zanimalo, če je možno sistem povrniti v prvotno stanje. V prvem eksperimentu so uporabili vezje z RBS D ter OR1 z mutacijo ene baze. Po 4-urnem induciranju z AHL so celice 3-krat sprali z novim medijem in tako odstranili AHL. Nato je kultura rasla nadaljnjih 6 ur v svežem mediju brez AHL. Nato so spet dodali AHL do končne koncentracije 140 nM. Drugi impulz je dosegel isto intenziteto kot prvi impulz. V drugem eksperimentu so proučili sposobnost vezja, da regenerira impulz, glede na čas, ki je minil po prvi indukciji z AHL. Po približno 140 minutah je bilo vezje sposobno regenerirati drugi impulz s približno enako intenziteto kot jo je imel prvi impulz. Časovni interval po zaznanem dogodku, v katerem se vezje ne odziva na nove signale, se imenuje refraktorno obdobje. Definira čas, ki ga sistem potrebuje da se povrne nazaj v osnovno stanje. Na to obdobje vplivata predvsem razgradnja CI ter zmanjšanje vsebnosti LuxR-AHL dimerov, ki aktivirajo izražanje CI. Tako CI, kot LuxR-AHL dimeri so odvisni od koncentracije AHL. Torej začetna koncentracija induktorja AHL vpliva na refraktorno obdobje sistema.

Vpliv koncentracije induktorja ter hitrosti naraščanja le-te

Še ena pomembna lastnost generatorja impulzov je njegova občutljivost na različne vstopne koncentracije. Avtorji so proučili impulze, generirane pri različnih koncentracijah AHL. Pri koncentracijah AHL, višjih od 47 nM, imajo impulzi isti začetni naraščajoči naklon in približno enak maksimum. Še višje koncentracije AHL (več od 140 nM) izkazujejo podoben impulzni odziv in sicer zaradi močnejše inhibicije s strani CI, ki kompenzira močnejšo aktivacijo luxPR. Pomembna je tudi hitrost povišanja koncentracije, ki vpliva na čas in nivo maksimalne amplitude impulza. Sposobnost zaznavanja stopnje povišanja AHL so avtorji pripisali variabilni zakasnitvi v represiji, ki je povezana z motivom usmerjene zanke. Ko je hitrost dodajanja AHL visoka, je začetno kopičenje GFP in CI visoko. Kmalu za tem CI utiša aktivnost luxPRcI-OR1 promotorja. Med tem časom GFP nastaja v velikih količinah. Rezultat je impulz s kratkim zamikom in visoko amplitudo. Ko pa je hitrost povišanja AHL nižja, sta začetni kopičenji CI in GFP nižji. Posledično traja dlje, da CI utiša omenjeni hibridni promotor. Zamik je daljši, kljub temu pa je skupna GFP ekspresija manjša, zaradi komponente usmerjene zanke. Ta komponenta sestoji iz transkripcije in translacije CI, dimerizacije in vezave na operator. Pri nižji stopnji transkripcije, transkripcija in translacija CI dominirata zamik v represiji. Dimerizacija in vezava na operator nimata več pomembne vloge pri tem zamiku. Zato bo (za vsak nivo AHL med naraščanjem koncentracije induktorja) represija luxPRcI-OR1 s strani CI višja kot pred tem. Posledično bo GFP ekspresija (prek tega hibridnega promotorja) zavrta pri nižji koncentraciji AHL.

Prostorsko obnašanje

Prejemniške celice lahko razlikujejo med komunikacijo z bližnjimi in oddaljenimi signalizacijskimi celicami. V povprečju so prejemniške celice, ki so bile bližje signalizacijskim celicam, začele fluorescirati prej ter povzročile impulz z višjo intenziteto v primerjavi s celicami, ki so bile bolj oddaljene. Prejemniške celice, ki so bile najbolj oddaljene od signalizacijskih celic, sploh niso izkazale opaznega odziva.

Zaključek

Avtorji proučevanega članka so prikazali in analizirali večcelični bakterijski sistem, ki so ga zgradili iz enostavnih in dobro okarakteriziranih komponent. Postopno povečanje koncentracije signalne molekule je imelo za posledico impulzni odziv. Maksimalna amplituda in trajanje impulza sta odvisna od končne koncentracije induktorja ter hitrosti povišanja le-te. Sposobnost razlikovanja med različnimi hitrostmi povišanja koncentracije induktorja omogoča sistemu edinstveno prostorsko in časovno obnašanje. Prejemniške celice se lahko odzovejo na komunikacijo bližnjih celic, ki pošiljajo signale, istočasno pa popolnoma ignorirajo komunikacijo celic, ki pošiljajo signale, a so dlje stran. To je mogoče kljub dejstvu, da je koncentracija AHL sčasoma povsod visoka. Ta impulzni generator predstavlja pomemben gradnik v sintezni biologiji. Programirano koordinirano obnašanje ima aplikacije na številnih področjih, npr. v tkivnem inženirstvu, izdelavi biomaterialov ter zaznavanju okolja. Zaradi podobnosti z naravno prisotnimi motivi usmerjene zanke lahko tak impulzni generator služi kot model za izboljšanje razumevanja takih sistemov.

Viri

S. Basu, R. Mehreja, S. Thiberge, M.-T. Chen, R. Weiss. Spatiotemporal control of gene expression with pulse-generating networks. PNAS. 2004.101:17

Ž. Ramšak. PRISTOPI K ANALIZI RAZLIČNIH TIPOV PODATKOV ZA BOLJŠE RAZUMEVANJE OBRAMBNEGA ODZIVA KROMPIRJA (Solanum tuberosum L.) NA VIRUSNE OKUŽBE. Doktorska disertacija. UL, Biotehniška fakulteta. 2015.

D. Chmiest, et al. Spatiotemporal control of interferon-induced JAK/STAT signalling and gene transcription by the retromer complex. Nature Communications. 2016.7.

K. Hatta, S. Takagi, H. Fujisawa, M. Takeichi. Spatial and temporal expression pattern of N-cadherin cell adhesion molecules correlated with morphogenetic processes of chicken embryos. Developmental Biology. 1987.120:1.

Personal tools