Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali
Uvod
O stanju, v katerem se celica nahaja, nam veliko pove njen transkriptom, saj v sebi nosi ključne informacije o fiziologiji in fenotipu celice. Na osnovi prisotnosti določene RNA lahko torej sklepamo o določenem stanju celice in tako ločimo to stanje od drugih. S tehnikami, ki bi zaznale določeno RNA (vhodni signal) in jo bile sposobne pretvoriti v nek izhodni signal, bi lahko stanje celice povezali z neko želeno funkcijo oz. nekim biokemijskim procesom. To bi lahko bila osnova za terapevtike, ki bi postali učinkoviti le v bolezenskem stanju celice. Poleg tega pa bi nam taka tehnika omogočila, da bi stanje RNA v celicah pretvorili v biomolekulski reporter, kar bi nam omogočilo vpogled v časovne in prostorske vzorce izražanja genov. Zaznavanje RNA v primerjavi s proteini ima določene prednosti, kot na primer, da temelji na enostavnih interakcijah z Watson-Crickovimi baznimi pari in da lahko spremljamo tudi nekodirajoče RNA [1].
Primer take tehnike je naprava RENDR oziroma zaznava RNA, omogočena z ribocimom (Ribozyme-ENabled Detection of RNA). Ta deluje na principu samoizrezovalnega introna tipa 1 oziroma ribocima, ki je razcepljen na dva fragmenta in ustavljen pred kodirajoče zaporedje reporterskega proteina. Ko je prisoten vhodni signal v obliki celične RNA, to omogoči nastanek funkcionalnega ribocima, zaradi česar pride do njegovega izrezovanja. S tem dobimo funkcionalno mRNA reporterja in posledično tudi reporterski protein, katerega prisotnost lahko spremljamo [1].
Izbira in optimizacija ribocima
Uporabili so ribocim iz enoceličnega migetalkarja Tetrahymena thermophila, ki je samoizrezovalni intron tipa 1 [1,2]. Ti katalizirajo svoje lastno izrezovanje iz prekurzorske RNA preko dveh zaporednih reakcij transesterifikacije, za začetek katerih pa potrebujejo eksogeni gvanozin, ki deluje kot nukleofil [2]. Zaporedje ribocima tvori sekundarne strukture, ki se nato zvijejo v vijačne strukture in tvorijo definirano 3D zvijte. Sestavlja ga ohranjena jedrna regija iz vijačnih domen P4-P6 in P3-P7 [1,2].
Kot prvi korak pri izdelavi naprave RENDR so naredili poskus, kjer so dokazali delovanje ribocima. Celice Escherichia coli so transformirali s konstruktom, ki je nosil zapis za zeleni fluorescenčni protein (GFP), znotraj katerega je bil ustavljen zapis za ribocim. S tem je bila onemogočena translacija in je do fluorescence prišlo samo zato, ker se je ribocim izrezal iz mRNA [1].
Vendar pa so za delovanje RENDR potrebovali cepljen ribocim na dva fragmenta, ki bosta tvorila aktiven kompleks le v primeru, da se vežeta na vhodni signal RNA. Morali so torej poiskati taka mesta cepitve, ki so v odsotnosti vhodnega signala preprečevala tvorbo kompleksa, med tem ko so jo v prisotnosti vhodnega signala favorizirala. Ker je bilo možnih 419 cepitvenih mest, so pripravili knjižnico različic cepljenega ribocima s pomočjo transpozonov. Da so ugotovili, katera različica je primerna, so na konec enega in začetek drugega fragmenta ribocima dodali komplementarni usmerjevalni RNA, kar je ponazorilo vezavo na vhodni signal RNA. Za ponazoritev odsotnosti vhodnega signala pa so naredili inhibitor v obliki komplementarnega zaporedja ene od usmerjevalnih RNA, zapis za katerega je bil pod inducibilnim promotorjem. Ustreznost cepitvenih mest so spremljali tako, da so celice E. coli transformirali z zapisi za različice ribocimov in zapisom za inhibitor ter fluorescenco izhodnega signala spremljali z ločevalnikom fluorescenčno označenih celic (FACS). Ustrezna cepitvena mesta so torej bila tista, ki so v odsotnosti inhibitorja dala visok signal in zelo malo signala, ko je bil prisoten inhibitor. Taka cepitvena mesta so bila na neohranjenih regijah ribocima in na regijah, ki so dostopna topilu [1].
Detekcija vhodnih signalov RNA
V naslednjem koraku so morali napravo spremeniti tako, da je zaznala vhodni signal. To deluje na principu, da usmerjevalni RNA na fragmentih ribocima tvorita bazne pare s tarčno RNA. Ti tarčni zaporedji na vhodnem signalu RNA, morata biti blizu skupaj, da prideta fragmenta ribocima ob vezavi dovolj blizu, da lahko tvorita aktiven ribocim. Delovanje so testirali na sedmih različicah ribocima, ki so imela različno cepitveno mesto in so tvorila 163 baznih parov s tarčno sintetično RNA. Najboljša naprava je dala 93-kratno povečanje izhodnega signala ob prisotnosti vhodnega signala – to je bila različica, ki je imela cepitveno mesto na začetku ribocima [1].
Nato pa so še želeli določiti, kolikšna je optimalna dolžina usmerjevalnih RNA. Pomagali so si tudi z modelom, ki upošteva strukturo in prosto energijo vseh RNA, ki nastopajo v reakciji, torej dveh usmerjevalnih in ene tarčne RNA. Upošteva prosto energijo začetnega stanje, ko je vsaka RNA posebej, in hibridnega stanja, ko se usmerjevalni povežeta s tarčno RNA. Predpostavili so, da hibridizacija spodbudi nastanek kompleksa in izrezovanje ribocima. Ugotovili so, da je bolje, če je več baznih parov hibridiziranih, torej če je daljše zaporedje usmerjevalne RNA oziroma če je zaporedje bolj komplementarno [1].
Razvoj modularne naprave
Uspeli so torej narediti napravo RENDR, ki je ob prisotnosti sintetične RNA dala izhodni signal v obliki proteina GFP, ki so ga zaznali z merjenjem fluorescence. Cilj pa je bila naprava, ki jo lahko enostavno prilagodiš na svoj poskus, torej da jo prilagodiš na drugačen vhodni signal in da lahko spremeniš tudi izhodni signal (da ni edina možnost GFP). V ta namen so zapis za ribocim prestavili med zaporedje za RBS in kodirajoče zaporedje izhodnega signala in tako omogočili enostavno spreminjanje izhodnega signala. Uspešnost naprave z različnimi izhodnimi signali so potrdili s tremi poskusi, kjer so z različnimi izhodnimi signali omogočili različen tip detekcije [1].
Prvi primer je bila kolorimetrična detekcija, kjer so za izhodni signal vzeli kodirajoče zaporedje encima monooksigenaze s flavinom (FMO), ki katalizira pretvorbo indola v indoksil, ta pa se spontano pretvori v indigo barvilo. Celice E. coli, transformirane z zapisom za to napravo RENDR, so se v prisotnosti tarčne RNA kot vhodnega signala obarvale indigo, kar se je videlo s prostim očesom. Drugi primer je bila detekcija nastanka plina, kar so omogočili z encimom metil halid transferaza kot izhodnim signalom, ki pretvori S-adenozil metionin in bromid v CH3Br. Kot tretji primer pa so poskusili še z CRISPR interferenco, kjer so za izhodni signal uporabili neaktivni protein Cas9 (dCas9), ki na ravni transkripcije inhibira izražanje proteina GFP, ki je zapisan v genomu. Ob prisotnosti vhodnega signala so tako dobili manjši signal fluorescence. Z vsemi temi poskusi so dokazali, da lahko v napravi RENDR spreminjamo izhodne signale, ki nam omogočajo fluorescenčno, kolorimetrično in plinsko detekcijo oziroma lahko vplivamo tudi na regulacijo izražanja genov [1].
Kot zadnje pa so še vzpostavili navodila, kako iz osnovne naprave spremeniti usmerjevalne RNA, da bodo prilagojene na vhodni signal. Uspešnost so dokazali s poskusi na treh različnih vhodnih signalih, pri čemer je bil izhodni signal GFP; to so bile mRNA rdečega fluorescenčnega proteina, katehol 2,3-dioksigenaze in proteina za rezistenco proti tetraciklinu [1].
Ponazoritev delovanja naprave na primeru
Delovanje naprave RENDR so ponazorili na primeru, kjer so želeli kolorimetrično zaznati, če je v bakterijah E. coli prisoten gen za odpornost proti kanamicinu (kanR). Celice E. coli so transformirali s plazmidom RENDR, kjer so spremenili usmerjevalne RNA tako, da so bile komplementarne mRNA gena kanR, za izhodni signal pa so uporabili encim FMO. Obarvale so se samo celice, ki so imele prisoten gen kanR. S tem so dokazali, da lahko naprava RENDR zazna fenotip na nivoju mRNA [1].
Zaključek
Čeprav že obstajajo podobni načini spremljanja vzorcev transkripcije, pa ima naprava RENDR prednosti v tem, da se lahko uporabi širok nabor izhodnih signalov, ki so lahko tudi nukleinske kisline, da je prenosljiva med različnimi gramnegativnimi bakterijami in da deluje v živih celicah. Poleg tega se predvideva, da bo naprava omogočala izvedbo genetskega programiranja le v določeni vrsti celic kot odgovor na fiziologijo ali fenotip celice. Čeprav za enkrat naprava deluje le v bakterijah, pa napovedujejo uporabo v sintezni biologiji sesalskih celic, v katerih bi lahko na primer izvedli genetski program kot odgovor na zaznavo biološkega označevalca bolezni [1].
Literatura
[1] L. Gambill, A. Staubus, K. W. Mo, A. Ameruoso, in J. Chappell, „A split ribozyme that links detection of a native RNA to orthogonal protein outputs“, Nat Commun, let. 14, št. 1, str. 543, feb. 2023.
[2] S. Li, M. Z. Palo, X. Zhang, G. Pintilie, in K. Zhang, „Snapshots of the second-step self-splicing of Tetrahymena ribozyme revealed by cryo-EM“, Nat Commun, let. 14, št. 1, str. 1294, mar. 2023.
