Razodetje povezovalnega kompleksa med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem s presejalnim testom sintezne biologije

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Contents

Uvod

S pomočjo umetnega proteinskega konstrukta, ki lahko funkcijsko nadomesti naravno prisoten protein v celici, lahko zelo natančno določimo sestavo slednjega. V tem primeru je bila na ta način razkrita povezava med mitohondrijem in endoplazemskim retikulumom.

Sodelovanje med organeli

Evkariontske celice so tekom evolucije preko kompartmentalizacije razdelile funkcije na posamezne organele. To je po eni strani zelo učinkovito zaradi prilagojenega kemijskega okolja, vendar je prav tako med temi organeli nujna komunikacija in izmenjava raznovrstnih molekul. Kot primer, fosfolipidi so sintetizirani v endoplazemskem retikulumu, ki se nato razvaža po celici s pomočjo vezikularnega transporta, v katerega pa mitohondrij ni vključen [1].

Študije so pokazale, da transport prej omenjenih fosfolipidov in prav tako kalcijevih ionov med endoplazemskim retikulumom in mitohondrijem poteka na točkah, kjer prihaja do stika med dvema organeloma. Ti »stiki« bi lahko bili ključni za nadzor citosolne in mitohondrijske koncentracije kalcijevih ionov. Z njimi povezujejo tudi proteini IP3 receptor (Ca2+ kanalček), VDAC (mitohondrijski od napetosti odvisen anionski kanalček), šaperona grp75 in σ1R, sortirni protein PACS-2 in mitofuzin Mfn2 [1].

Chimera

V tej raziskavi so uporabljali sev Saccharomyces cerevisiae. Ideja je bila, da bi vzeli mutante tega seva, ki imajo okvarjeno povezavo med organeloma, kar bi povzročilo opazne posledice v celici, vendar bi jih lahko preprečili z uporabo umetnega proteina, ki bi nadomestil njegovo funkcijo. Ustvarili so umetni protein, ki so ga poimenovali ChiMERA – »construct for helping in mitochondria-ER associaton« oz. konstrukt, za pomoč povezovanja mitohondrija in ER. Sestavljen je bil iz N-končne mitohondrijske signalne sekvence, transmembranske domene izpeljane iz protein Tom70, centralnega modula iz GFP proteina in C-končnega ER repnega sidra izpeljanega iz Ubc6 [1].

Mitohondrij lahko zavzema sferično obliko podobno fižolu, ali pa razvejano tubularno omrežje. V primeru S. cerevisiae je mitohondrij v celicah divjega tipa (wt) razvejan v bližini membrane. Takšna oblika se vzdržuje s pomočjo fizije in fuzije, ki se dogaja na približno vsaki dve minuti [2]. V tej raziskavi so sevi z mutiranimi in okvarjenimi geni, ki sodelujejo v povezavi ER-mitohondrij, izgubili takšno obliko.

Konstrukt ChiMERA se je v največji meri lokaliziral na membrano ER in je označil tako periferni kot perinuklearni ER, mitohondrij pa je označil le na mestih kontakta z ER. Sevi divjega tipa so brez izražanja ChiMERE imeli mitohondrij prej opisane tubularne mreže, izražanje konstrukta pa je dodalo nekaj točkastih struktur na mestih kontakta z ER. S tem so pokazali, da umetni povezovalec izvaja želeno funkcijo. Močnejšo afiniteto konstrukta do ER so razložili z večjo dominanco vezavnega zaporedja za ER v primerjavi z vezavnim zaporedjem za mitohondrij v konstruktu [1].

Identifikacija povezave ER-mitohondrij

Za izražanje konstrukta je bil uporabljen kvasovkin centromerni plazmid. Približno 100 000 kolonij je bilo tretiranih s etilmetansulfonatom (EMS) za mutacijo, izmed nastalih mutant pa so dobili dve, ki nista mogli rasti brez prisotnosti plazmida. S pomočjo genske komplementacije so ugotovili, da sta obe mutaciji prisotni na genu MDM12. Mdm12 je periferni protein zunanje mitohondrijske membrane, ki se ga da izolirati v kompleksu z Mmm1 in Mdm10. Lokalizira se v točkastih strukturah na mitohondrijskem omrežju še skupaj s četrtim proteinom, Mdm34. Vsi štirje proteini so nujni za aerobno rast in ohranjanje pravilne tubularne strukture mitohondrija [1].

V naslednji fazi so preverili v kolikšni meri izražanje ChiMERE kompenzira okvaro povzročeno z delecijo vsakega posameznega gena – MMM1, MDM10, MDM12 in MDM34. Na YP ploščah, ki omogočajo fermentacijo, je razlika v uspešnosti rasti slabo opazna, medtem ko je rast na respiracijskih ploščah YPEG vidno uspešnejša ob prisotnosti umetnega konstrukta pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ . S pomočjo umetnega konstrukta jim je prav tako uspelo rešiti tubularno strukturo mitohondrija pri sevih mdm12Δ in mdm34Δ, kar se ujema s prejšnjimi rezultati aerobne rasti. Novoidentificirani kompleks Mmm1/Mdm10/Mdm12/Mdm34 so poimenovali ERMES. Predvidevali so, da nekatere komponente ERMES-a pripadajo ER, nekatere pa mitohondriju. Mutacija v katerikoli komponenti je usodna za stik. Kadar se stik prekine, te ostanejo zasidrane v matični organel [1].

Študije kompleksa ERMES

Najprej so zamenjali gen za vsako komponento ERMES-a z genom za fuzijski protein z GFP. Tako so imeli seve MMM1-GFP, MDM12-GFP, MDM34-GFP in MDM10-GFP. Nato so s fluorescenčno mikroskopijo opazovali WT in mutirane seve, kjer so mutirali vsako komponento ERMES-a posebej tako, da ni bila več funkcionalna.

  • Vsi WT izhodni štirje sevi z zapisi za fuzijski protein so izkazovali točkaste strukture (sklepali na stike ER-mitohondrij), razen Mdm10-GFP, kjer so signali bili bolj široki (Mdm10 je sestavni del SAM kompleksa v OMM, ima še druge funkcije).
  • Sevi z mutiranim MDM34 ali MDM10 so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na mitohondrij.
  • Sevi z mutiranim MMM1 so izgubili ERMES stike, vsi fuzijski proteini pa so se lokalizirali na endoplazemski retikulum.
  • Sevi z mutiranim MDM12 so izgubili ERMES stike, v primeru mutacije/okvare gena MMM1 se Mdm12-GFP lokalizira na mitohondrij, ob mutaciji/okvari MDM10 in MDM34 pa na ER.

V skladu s temi rezultati so postavili model kompleksa ERMES: Mdm34 in Mdm10 sta vezana v membrano mitohondrija, Mmm1 na membrano ER, protein Mdm12 pa je vezan na Mdm34 in Mmm1 in ni lokaliziran v nobeni membrani [1].

Njihov model je torej predpostavljal, da je protein Mmm1 vstavljen v membrano ER, medtem ko so dosedaj menili, da je sestavni del mitohondrijske notranje ali zunanje membrane. Ker se to ne ujema, so se odločili natančneje preveriti tudi to.

  1. test: Veliko integralnih ER proteinov je N-glikoziliranih na lumenski domeni in štiri potencialna mesta za glikozilacijo se nahajajo tudi na N-koncu pred transmembransko domeno. Da bi preverili, če so ta mest res glikozilirana, so gen za Mmm1 zamenjali z zapisom za fuzijski protein s HA (hemaglutinin). Nato so imeli tri vzorce – prvi je bil celični lizat tretiran z EndoHF (odstrani N-vezane glikane), drugi lizat ni bil tretiran z EndoHF, tretji pa je bil lizata seva z WT zapisom za Mmm1 (kontrola). Izvedli so NaSD-PAGE ter western prenos s protitelesi proti hemaglutininu. Lizat, tretiran z EndoHF je pripotoval dlje, kar pomeni, da je protein res glikoziliran in potemtakem integralni ER membranski protein [1].
  2. test: v celico so vnesli konstrukt, ki izraža protein Mmm1, fuziran s HA in cepitvenim mestom za TEV proteazo. Prav tako so vnesli zapis, za TEV proteazo s signalnim petidom za ER (Kar2) ali pa mitohondrij (Su9). Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, izvedli western prenos s anti-HA protitelesi, in dobili dve lisi v sistemu, ki je izražal Kar2-TEV proteazo. To pomeni, da se protein Mmm1 res nahaja na ER [1].

Vloge kompleksa ERMES v celici

Genetske študije so pokazale, da so sestavni deli ERMES-a močno korelirani s še dvema proteinoma – Gem1 in Psd1. Prvi je kalcij-vezavna GTPaza iz družine rho, ki sodeluje pri preoblikovanju mitohondrija in njegovem pravilnem dedovanju, drugi pa fosfatidilserin dekarboksilaza, ki sodeluje pri de novo biosintezi aminoglicerofosfolipidov. Ta korelacija potrjuje, da je ERMES pomemben za medorganelno izmenjavo kalcija in fosfolipidov [1].

Najprej so preverili vsebnost fosfolipidov v mitohondriju pri celicah, z okvarjenim ERMES kompleksom (izbrali so mdm12Δ sev). Vrednosti vseh fosfolipidnih razredov so bile primerljive z WT razen kardiolipin (CL). CL je fosfolipid specifičen za mitohondrij, nujen za respiracijo in ga je bilo pri mutiranih celicah (mdm12Δ, psd1Δ) opazno manj. Celice, ki so imele okvarjen kompleks ERMES ali pa gen PSD1 in hkrati deletiran gen CRD1, ki kodira za CL sintazo, niso bile sposobne preživeti (sintezno smrtna delecija) [1].

Ker so bile vrednosti ostalih fosfolipidov v mutiranih sevih primerljive s sevom divjega tipa, sklepajo, da so v celici kompenzacijski mehanizmi, ki zmanjšajo vpliv okvare ERMES-a. To so preverili na pretvorbi fosfatidilserina (PS) v fosfatidilholin (PC) s pomočjo metode s pulznim označevanjem. Je metoda, ki se uporablja za spremljanje celičnih procesov skozi čas s pomočjo označene snovi (pulza) in nato iste neoznačene snovi (lovljenje). Celico se najprej izpostavi označeni snovi, kjer je najpogosteje radioaktivno označen atom ene molekule (35S, 14C, 3H…). Ta molekula gre nato skozi metabolne poti v celici, nato pa se celico izpostavi presežeku neoznačene molekule. Pomemben je čas izpostavljenosti posamezni molekuli. Vzorce se nato pregleda na kvantitativnih metodah [3].

Tukaj so izvedli 14C-serin pulzno označevanje. Najprej so jih izpostavili radioaktivno označenemu serinu dve uri, nato pa neoznačenemu serinu. Po različnih časih so odvzeli alikvote, iz njih izolirali fosfolipide in jih kvantitativno analizirali s tankoplastno kromatografijo. Takšen poskus so izvedli na psd2Δ ozadju, kjer je gen PSD2 deletiran. Naravno je prisoten v vakuoli in bi lahko vplival na rezultate. WT sev je pretvarjal PS v PC uspešno, mutanta psd1Δ psd2Δ ni izvajala te funkcije, mutante z okvarami v sestavnih delih ERMES-a pa so izvajale to funkcijo dva- do petkrat manj. S tem so potrdili, da okvara v ERMES-u ovira izmenjavo fosfolipidov med ER in mitohondrijem. Pri mutantah mdm12Δ in mdm34Δ je izražanje ChiMERE v močno obnovilo pretvorbo PS v PC [1].

Zaključek

V tej raziskavi so uspešno identificirali sestavne dele povezovalnega kompleksa med ER in mitohondrijem s pomočjo umetnega konstrukta, ki je posnemal njegovo funkcijo. Pokazali so, da je ta kompleks odgovoren za transport fosfolipidov, njegova okvara pa močno ovira rast celice. V celici je verjetno takšnih povezav med organeli več, katere bi se dalo na podoben princip identificirati in s tem prispevati k razumevanju fiziologije celic.

  1. 1.00 1.01 1.02 1.03 1.04 1.05 1.06 1.07 1.08 1.09 1.10 1.11 Kornmann, Benoît et al. “An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen” Science (New York, N.Y.) vol. 325,5939 (2009): 477-81
  2. Shaw, Janet M and Jodi Nunnari. “Mitochondrial dynamics and division in budding yeast” Trends in cell biology vol. 12,4 (2002): 178-84
  3. Simon E., Kornitzer D. »Pulse-Chase Analysis to Measure Protein Degradation« Methods in Enzymology, vol. 636, (2014): 65-75
Personal tools