Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje

Uvod

LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.

Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.

Mehanizem retrotranspozicije LINE-1

Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.

Regulacija aktivnosti LINE-1

Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.

Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji

Na predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 na tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.

Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA na predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena na stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže na stopnji osemceličnega zarodka.

Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je na predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.

Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.

N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.

Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).

Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah

Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo.

Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri Drosophila melanogaster (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.

Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.

Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.

Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka

Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.

Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.

Regulacija LINE-1 v somatskih celicah

V večini somatskih celicah organizma je L1 repremiran in njegova aktivacija je po navadi povezana z različnimi patologijami (rak, nevropsihiatrične in avtoimune bolezni) ali starostnimi spremembami. Izjema je možgansko tkivo, kjer je L1 aktiven v nevronih in glijah.

L1 je v glavnem repremiran z metilacijo DNA in specifičnimi modifikacijami histona, kar zmanjša dostopnost kromatina v L1 regijah somatskega tkiva. Proteini iz družine sirtuinov so povezani z mnogimi celičnimi procesi (popravljanje DNA, uravnavanje dolžine telomer, anti-vnetni procesi ...) in ena izmed funkcij proteina SIRT6 je tudi zaviranje L1. To se dogaja preko dveh poti. V prvi pride do mono-ADP ribozilacije faktorja KAP1, kar stimulira tvorbo heterokromatina, v drugi pa prihaja do interakcije SIRT6 s transkripcijskim faktorjem MePC2, ki je vključen v proces metilacije L1 promotorske regije.

Posttranskripcijsko se L1 v somatskih celicah specifično inhibira preko RNA interference z miR-128, ki skupaj z Ago proteinom tvori RISC kompleks. Možna mehanizma sta dva; miR-128 se lahko direktno veže na ORF2 regijo L1 mRNA, lahko pa inhibira celične faktorje, ki omogočijo transport L1 RNP iz citoplazme v jedro – transportin-1 (TNPO1) in hnRNPA1. Obstaja tudi alternativen mehanizem, v katerem RISC kompleks neposredno prepozna lasnično zanko pre-miRNA v 5'UTR regiji L1 transkripta in jo prereže, kar prepreči njegovo nadaljnje zorenje. V inhibicijo L1 so vključeni tudi drugi nuklearni ribonukleoproteini (R, Q, L), a njihov mehanizem inhibicije še ni raziskan.

L1 inhibirajo protivirusni faktorji. Ti se aktivirajo ob prisotnosti virusnih nukleinskih kislin in ob prisotnosti retrotranspozonov. Študije so pokazale, da L1 mRNA sproži imunski odziv in poveča nivo interferona β. INFB inducira encim RNazo L, le-ta pa cepi RNA in posledično vodi v pomembno znižanje ORF1 in ORF2 L1 proteinov. Močan inhibitor L1 je tudi MOV10 helikaza RNA. Mehanizem te helikaze ni popolnoma znan, znano pa je, da MOV10 z drugimi protivirusnimi proteini tvori kompleks, ki v interakciji z L1 transkripti tvori stresne granule, ki se potem nadaljnje razgradijo. Protein SAMHD1 (SAM domain and HD domain-containing protein 1) inhibira reverzno transkripcijo L1 z vezavo na ORF2 in zmanjša izražanje ORF2 proteinov. Družina proteinov APOBEC3 je ena prvih odkritih celičnih obrambnih sistemov proti nekontroliranem širjenju L1 in je prisotna zgolj pri človeku. Dogaja se na posttranskripcijskem nivoju preko deaminacijsko odvisnega ali neodvisnega mehanizma. Za L1 najbolj aktiven encim hA3A z deaminazno aktivnostjo pretvarja citozin v uracil v prvi verigi L1 cDNA transkripta. hA3C ali hA3DE delujeta po neodvisnem mehanizmu in blokirata reverzno transkripcijo L1 z interakcijo z L1 kompleksom RNP in ORF1 v celični citoplazmi.

V zadnji fazi retrotranspozicije oz. v integraciji v genom, inhibicija poteka preko proteinov, ki s svojim delovanjem popravljajo prekinitve enojne in dvojno zvite molekule DNA. K inhibiciji L1 veliko prispevajo faktorji, ki sodelujejo v postreplikativnih modifikacijah DNA (npr. encim ATM, ki ob poškodovanju DNA aktivira različne faktorje in komplekse, kateri popravljajo DNA – deficit ATM ali njemu podobnih proteinov vodi v povišano aktivnost L1). V regulacijo L1 so vključeni faktorji celičnega cikla. Na 5'UTR promoter L1 se lahko veže transkripcijski faktor p53. Ta povzroči inhibitorne posttranslacijske modifikacije na N-koncih aminokislinskih ostankov histona. Inhibicijsko delujeta tudi faktorja p21 in p27 (Vezava na ORF2, preprečitev integracije).

Retrotranspozicijo L1 promovira histonska demetilaza KDM4B, ki promovira demetilacijo H3K9me3 histonov, njena aktivnost pa je povečana v različnih tipih raka. Pozitivno regulacijo L1 povzroča transkripcijski faktor RUNX3 (runt-domain transcription factor), ki se veže na regijo 5'UTR. Omeniti je potrebno tudi transkripcijski faktor FOXA1, katerega delovanje na L1 so opazili pri celičnem staranju – večje izražanje imunskih faktorjev, ki ga ne spremlja repremija L1 - in aktivacija L1 skupaj s prisotnim vnetjem je dober pokazatelj staranja. Spreminjanje regulacije L1 je torej potencialna tarča zdravljenja s starostjo povezanih bolezni.

Viri

[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.

[2] Wu, You, Wenqiang Liu, Jiayu Chen, Shuaitong Liu, Mingzhu Wang, Lei Yang, Chuan Chen, et al. “Nuclear Exosome Targeting Complex Core Factor ZCCHC8 Regulates the Degradation of line1 RNA in Early Embryos and Embryonic Stem Cells.” Cell Reports 29, no. 8 (2019). https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.055.

[3] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.

[4] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164.

[5] Thomas, Charles A et al. “LINE-1 retrotransposition in the nervous system.” Annual review of cell and developmental biology vol. 28 (2012). https://doi:10.1146/annurev-cellbio-101011-155822