Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Synthesis of bacteriophage lytic proteins against Streptococcus pneumoniae in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii

V zadnjih letih postaja odpornost patogenih bakterij na antibiotike vedno bolj pereč problem, zato spada razvoj novih antibakterijskih učinkovin med pomembnejše cilje zdravstvenih organizacij. Primer antibakterijskih proteinov so tudi endolizini, ki jih proizvajajo bakteriofagi v času litičnega cikla. Ti protein cepijo točno določene vezi v peptidoglikanih, ki tvorijo celično steno bakterij. Trenutno je njihova uporabnost omejena na po Gramu pozitivne bakterije, saj pri le-teh delujejo kot eksolizini in povzročijo lizo bakterije, saj napadejo izpostavljeni peptidoglikanski sloj. Pri po Gramu negativnih bakterijah pa peptidoglikanski sloj ni izpostavljen zunanjemu okolju, zato naravni endolizini ne morejo povzročiti lize celice. Prednost endolizinov pred klasičnimi antibiotiki je tudi v tem, da gre za visoko specifične antibakterijske encime, ki ne poškodujejo bakterij, ki so del človeške mikrobiote. Zaradi tega je pomembno, da razvijemo proizvodni sistem, ki bo omogočal poceni proizvodnjo rekombinantnih endolizinov, ki bodo hkrati ustrezali vsem varnostnim predpisom. V ta namen so raziskovalci iz Velike Britanije razvili transgene linije mikroalge Chlamydomonas reinhardtii, ki v kloroplastih izražajo endolizina Pal in Cpl-1. Za izražanje v kloroplastih so se odločili, ker njihovo okolje posnema bakterijsko okolje v katerem se naravno izražajo endolizini s to razliko, da v kloroplastih ni elementov celične stene bakterij, ki jo napadajo endolizini.

Contents

Priprava brezmarkerskih transgenih linij C. reinhardtii

V kloroplastno DNA so vnesli gena za endolizina Pal in Cpl-1, ki delujeta antibakterijsko proti patogeni bakteriji Streptococcus pneumoniae. Oba gena so sintetizirali de novo, pri čemer so predhodno optimizirali kodon za izražanje v kloroplastih izbrane mikroalge. Za lažjo detekcijo so na oba sintetična gena dodali tudi hemaglutininsko (HA) oznako. Gena so vnesli v dva različna vektorja, ki omogočata izražanje v kloroplastih pod kontrolo dveh različnih promotorjev. Oba vektorja omogočata integracijo ekspresijske kasete na nevtralno mesto v kloroplastnem genomu, ki se nahaja navzdol od gena psbH, ki zapisuje za esencialno komponento fotosistema II. Transformirali so linijo C. reinhardtii, ki ima okvarjen gen psbH, in v primeru uspešne integracije v genom so to zaznali preko ponovne vzpostavitve fototrofije. Pravilno vstavitev v genom in homoplastičnost so potrdili s PCR in s prenosom po Southernu.

Akumulacija Pal in Cpl-1 v kloroplastih

Prisotnost rekombinantnih proteinov v celičnih ekstraktih so potrdili s prenosom western, pri čemer so uporabili protitelesa proti HA-oznaki. Ugotovili so, da sta oba endolizina stabilna, se uspešno izražata in da njuno izražanje nima negativnega vpliva na rast C. reinhardtii. Poleg tega so primerjali tudi vpliv promotorjev na raven izražanja obeh endolizinov. Za nadaljnjo analizo so izbrali transgenske linije, ki so izražale endolizina pod vplivom promotorja psaA-1/5'-UTR, saj so pri teh linijah zaznali višji nivo izražanja.

Izolacija in kvantifikacija Pal in Cpl-1

Za izolacijo endolizinov iz celičnih ekstraktov so najprej uporabili ultracentifugiranje in nato so nadaljnjo izolacijo izvedli s kromatografijo za katero so uporabili šibek anionski izmenjevalec (DEAE celuloza) in holin kot eluent. Tako so očistili oba endolizina in nato so optimizirali še celoten proces izražanja, da so dosegli čim boljši donos. Največji donos so dosegli z izražanjem pod miksotrofnimi pogoji v zaključku logaritmske faze rasti. Kvantifikacijo so nato izvedli s prenosom western in ugotovili, da oba endolizina predstavljata približno 1 % vseh topnih proteinov kar ustreza približno 1,3 mg obeh proteinov na gram suhe mase alg.

Antibakterijska aktivnost Pal in Cpl-1

Antibakterijsko aktivnost so analizirali z merjenjem optične gostote suspenzije celic in z določanjem kolonijskih enot S. pneumoniae. Oba endolizina sta povzročila lizo bakterijskih celic, kar so zaznali kot znižanje optične gostote pri 595 nm (OD595). Učinkovitost endolizinov so preverili z različnimi serotipi S. pneumoniae in tako ugotovili, da sta učinkovita tudi proti serotipom, ki so odporni na določene antibiotike. Pokazali so tudi, da sta endolizina visoko specifična, saj nista vplivala na druge vrste bakterij.

MBT seminarji 2017

Personal tools