Sporadicate

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.

Problem

Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so želeli razviti nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij B. subtilis, ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

Načrt dela

Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor B. subtilis tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore B. subtilis bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah B. subtilis bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

Teoretično ozadje

Hitin

Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina v glavnem direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

B. subtilis

Spore B. subtilis so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. B. subtilis izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko normalno delijo [1].

Potek dela

Hitinski predstavitveni sistem

Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma B. pumilus, ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

Samorazgrajujoči plazmid

Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se z germinacijo razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira z germinacijo, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

Receptor za reaktivacijo spor

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V B. subtilis poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].

Konstrukcija vektorjev, kloniranje in rezultati

Pri delu z B. subtilis so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za B. subtilis. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI. Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1]. CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. S tako sestavljenim plazmidom so (uspešno) transformirali bakterijske celice, a jim s PCR-jem na osnovi kolonije transformacije ni uspelo potrditi.

Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj so klonirali v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A. Tako so dobili 3 transkripcijske enote in do kompletnega konstrukta samorazgrajujočega-se plazmida so potrebovali le še enoto z reporterskim proteinom GFPmut3B. Plazmida, ki bi vseboval TU z GFPmut3B jim zaradi časovnih omejitev ni uspelo sestaviti [1].

Cilji za prihodnost

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1]. Z dodatnimi finančnimi vložki se nameravajo pri projektu posvetiti inženiringu germinantnega receptorja, ki je zaenkrat načrtovan le računalniško.

Viri

[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/