Synhesion
Synhesion je iGEM projekt ekipe iz Litve iz leta 2024, ki je zasedel 1. mesto v kategoriji biološka proizvodnja.
Uvod
Lepila so nepogrešljiva v vsakdanjem življenju in sodobni tehnologiji, tudi v medicini, kjer omogočajo delovanje naprav, kot so inzulinske črpalke in senzorji za glukozo. Vendar večina lepil temelji na sintetičnih, biološko nerazgradljivih spojinah, ki povzročajo okoljske in zdravstvene težave, vključno z alergijskimi reakcijami pri sladkornih bolnikih. Namen projekta Synhesion je razviti naravno bakterijsko lepilo na osnovi biokompatibilnih polisaharidov iz bakterije Caulobacter crescentus. Biokemijske poti za sintezo tovrstnih lepil iz vodnih bakterij so prenesli v industrijsko uporabno E.coli, ki omogoča približno sedemkrat hitrejšo in bolj nadzorovano rast.
Vektorski sistem za sintezo holdfasta v E. coli
Caulobacter crescentus je sladkovodna, gram-negativna bakterija, znana po svojem bifaznem življenjskem ciklu. Prehaja namreč iz gibljive oblike, opremljene z bičkom za kemotakso, v negibljivo (pritrjeno) obliko celice. Slednja se na trdne površine pritrdi s pomočjo specializirane adhezivne snovi, imenovane holdfast. Predhodne študije fizikalno-kemijskih lastnosti so pokazale, da je holdfast bakterije C. crescentus najmočnejše doslej odkrito biolepilo.
Poleg bakterije C. crescentus je bil v raziskavo vključen tudi sev Hirschia baltica, ki z njo deli homologno biosintezno pot in primerljive morfološke ter adhezivne lastnosti. Holdfast je sestavljen iz ponavljajočih se oligosaharidnih enot, ki jih tvorijo različne monosaharidne komponente. Te enote so organizirane v tetrade, ki jih sestavljajo glukoza, monosaharid (predvidoma N-manozaminuronska kislina ali ksiloza), N-acetilglukozamin in N-glukozamin. Sinteza holdfast polisaharidov v bakteriji C. crescentus vključuje 12 proteinov. Biosintezna pot se začne z encimom HfsE, ki katalizira prenos glukoze na lipidni nosilec. Glikoziltransferaze HfsJ, HfsG in HfsL nato dodajo manozaminuronsko kislino ter dve molekuli N-acetilglukozamina. Deacetilazi HfsH in HfsK nato kemijsko modificirata terminalni N-acetilglukozamin. Nastala tetrasaharidna enota se preko transmembranskega transporterja HfsF prenese v periplazmo, kjer se s pomočjo HfsC in HfsI polimerizira ter se nato skozi kanal sestavljen iz proteinov HfsB/HfsA/HfsD izloči v zunajcelični prostor.
Za prenos biosintezne poti holdfasta v E. coli sta bila skonstruirana dva ločena vektorja – prvi je vseboval gene za proteine, vključene v sestavo sladkorne tetrade (hfsE, hfsJ, hfsG, hfsL, hfsH, hfsK), drugi pa gene za proteine, odgovorne za polimerizacijo in transport (hfsA, hfsB, hfsD, hfsF, hfsC, hfsI). Geni so bili pridobljeni z amplifikacijo, neposredno iz genomov izvornih bakterij, pri čemer so uporabili tri različne seve – dva iz C. crescentus (CB2 in CB2A) in enega iz H. baltica. Geni so bili glede na njihovo organizacijo v genomu izvornih bakterij razporejeni med dva T7/lac promotorja. Kloniranje je bilo opravljeno z metodo sestavljanja Golden Gate.
Izražanje proteinov za sintezo holdfasta
Po uspešni konstrukciji plazmidov je bilo potrebno optimizirati izražanje celotnega sistema v bakteriji E. coli. V ta namen so optimizirali pogoje izražanja s testiranjem različnih gojišč, temperatur, koncentracij IPTG in trajanja indukcije na več sevih E. coli. Raven izražanja so spremljali z analizo celičnih lizatov s pomočjo SDS-PAGE in HPLC-MS proteomike. Najboljše izražanje proteinov iz C. crescentus so dosegli v sevu BL21 (DE3), gojenem v LB gojišču, pri temperaturi 37 °C, po indukciji z 0,5 mM IPTG in trajanju izražanja 3 ure. Za proteine iz H. baltica ni bilo mogoče identificirati pogojev, ki bi omogočili primerljivo raven izražanja.
Proizvodnja in čiščenje holdfasta
Po uspešni optimizaciji izražanja proteinov holdfasta so optimizirali pogoje, ki omogočajo učinkovito sintezo polisaharidnega lepila v bakteriji E. coli. Predhodne raziskave so pokazale, da zgolj izražanje vključenih genov še ne zadostuje za tvorbo funkcionalnega lepila, zato je bil cilj nadaljnjih eksperimentov optimizirati pogoje za sintezo holdfasta, omogočiti njegovo izolacijo ter ovrednotiti fizikalno-kemijske lastnosti pridobljenega produkta.
Za nadaljnjo optimizacijo pogojev so sistematično testirali različne vire ogljika in spremljali prisotnost produktov z metodo točkovnega nanosa (ang. dot blot), pri čemer so uporabili aglutinin pšeničnih kalčkov (ang. wheat germ agglutinin – WGA), ki specifično veže N-acetil-D-glukozamin – ključno komponento holdfasta. Rezultati so pokazali, da je za učinkovito sintezo bistvena prisotnost 1 % glukoze v gojišču, inkubacija čez noč pri 30 °C ter zmanjšana hitrost stresanja (170 rpm). V teh pogojih so celične kulture tvorile značilne obročaste strukture ob robu gojišča, v katerih so celice bile morfološko spremenjene in so na svoji površini izražale strukturo podobno biofilmu. Vezava WGA je potrdila prisotnost holdfasta, pri čemer se je glukoza izkazala kot najučinkovitejši substrat za sintezo, sledila pa ji je manoza.
Ker biosintezna pot holdfasta poteka preko začetnega prenosa UDP-D-glukoze na lipidni nosilec UndP, so predpostavili, da bi dodatek glukoze po zaključenem izražanju tarčnih genov lahko ugodno vplival na potek sinteze. Glede na to, da glukoza deluje kot negativni regulator lac operona, so njen dodatek časovno prilagodili, s čimer so preprečili zaviranje transkripcije v začetni fazi in omogočili zadostno akumulacijo ključnih biosinteznih proteinov.
Za določitev lokalizacije sintetiziranega holdfasta v gojišču so uporabili metodo točkovnega nanosa z lektinom WGA. Analizirali so več različnih vzorcev, vključno s celicami iz medija, supernatantom, materialom iz obroča, soniciranimi celicami in njihovimi supernatanti. Pri tem je bila prisotnost polisaharida potrjena le v topni frakciji celic obroča, kar nakazuje, da holdfast ostane vezan le na specifično celično subpopulacijo. Nadaljnji poskusi so pokazali, da so te celice žive in sposobne rasti na gojiščih, SDS-PAGE analiza pa je razkrila, da celice iz obroča izražajo biosintezne proteine v precej večjih količinah kot na novo transformirane bakterije. Skupni rezultati torej kažejo, da se holdfast sintetizira intracelularno in ostaja povezan z bakterijami, ki tvorijo obročasto strukturo in se ne izloča v medij.
Sestava holdfasta
Za analizo sestave holdfasta so uporabili ATR-FTIR spektroskopijo. Primerjava spektrov med CB2 vzorci in kontrolami je pokazala značilne vibracijske pasove, ki potrjujejo sintezo holdfasta. V spektru so se pojavili pasovi amidnih skupin (1618 cm⁻¹, 1517 cm⁻¹ in 1235 cm⁻¹), značilni za N-acetilglukozamin, ter pasovi, ki nakazujejo na prisotnost glikozidnih vezi (1169 cm⁻¹, 978 cm⁻¹, 931 cm⁻¹ in 833 cm⁻¹).
Preučili so tudi vlogo UDP-N-acetil-manozaminuronske kisline (UDP-ManNAc) v sestavi holdfasta. Z metodo homologne rekombinacije (Red/ET sistem) so iz sevov E. coli odstranili gen wecB, ki kodira encim UDP-N-acetilglukozamin 2-epimerazo, ki je ključna za pretvorbo UDP-GlcNAc v UDP-ManNAc. Uspešnost izbitja so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Kljub temu da delecija wecB ni vplivala na izražanje proteinov sistema CB2, sev HMS174(DE3)ΔwecB po indukciji ni tvoril značilnih obročev, kar kaže, da je prisotnost UDP-ManNAc nujna za funkcionalno biosintezo holdfasta.
Izolacija proteinov za pripravo z oligosaharidi označenih liposomov
Z namenom razširitve možnih aplikacij in ustvarjanja izhodišča za nadaljnje raziskave so preučili tudi izražanje in čiščenje posameznih proteinov, vključenih v sestavo sladkorne tetrade holdfasta. Ti proteini (HfsG, HfsH, HfsJ, HfsK, HfsL) katalizirajo zaporedno dodajanje sladkornih enot, pri čemer nastanejo glikolipidi. Glikolipidi imajo pomembno biološko vlogo v evkariontskih celicah, saj sodelujejo pri celični signalizaciji, prepoznavanju in vstopu patogenov. Njihova uporaba temelji na možnosti selektivne vezave na celične receptorje, značilne za specifična tkiva ali patološka stanja, kar omogoča ciljno dostavo učinkovin. Za izražanje ciljnih proteinov so izbrali sev E. coli BL21(DE3) in uporabili že optimizirane pogoje: 37 °C, 0,5 mM IPTG in 3 ure indukcije. Uspešno so izrazili vseh pet proteinov iz sevov C. crescentus CB2 in CB2A kot tudi iz bakterije H. baltica. Proteine, označene z oznako His tag, so očistili z ionsko izmenjevalno kromatografijo. Čiščenje proteinov iz H. baltica je bilo zahtevnejše in manj učinkovito, kar najverjetneje izhaja iz njihove naravne prilagoditve na morsko okolje z visoko koncentracijo soli. Domnevajo, da lahko to vpliva na njihovo konformacijo in topnost v eksperimentalnih pogojih z nižjo ionsko močjo.
Zaključki in nadaljnje usmeritve
Projekt Synhesion je vzpostavil osnovo za biosintezo bakterijskega lepila holdfast v gostiteljskem organizmu E. coli. Optimizirali so izražanje ključnih proteinov biosintezne poti lepila, identificirali cenovno ugoden substrat (glukozo) ter eksperimentalno potrdili biosintezo polisaharida. Kljub uspešnim začetnim rezultatom pa so se pojavili pomembni izzivi. Med njimi je ključno nepopolno izražanje polimeraz HfsC in HfsI, kar najverjetneje vpliva na nepravilno polimerizacijo in izločanje holdfasta.
Opaženo je bilo, da polisaharid ostaja vezan na celice in se ne izloča v medij, kar lahko izhaja iz aktivnosti endogenih E. coli ligaz ali prisotnosti fimbrij, ki imajo vlogo pri tvorbi biofilma. V ta namen sta kot potencialni tarči za nadaljnje genske modifikacije predlagana gena fimA in csgD, ki sta ključna za sintezo in regulacijo fimbrij. Dodatni izziv predstavlja tudi odsotnost učinkovitega protokola za čiščenje proizvedenega holdfasta, zaradi česar bo treba razviti nove pristope ter nato dodatno izvesti še fizikalno-kemijske in biokompatibilnostne analize (npr. AFM, HPLC-MS, ELISA).
Za industrijsko uporabo sistema bi bilo smiselno razmisliti o stabilnejših ekspresijskih pristopih brez uporabe antibiotikov in dražjih induktorjev, kot je IPTG – na primer z integracijo genske poti v genom ali uporabo umetnih bakterijskih kromosomov (BAC). Ob nadaljnji optimizaciji in kliničnem testiranju bi lahko tako bioosnovano lepilo postalo okolju prijazna in medicinsko varna alternativa sintetičnim lepilom, na primer za pritrditev inzulinskih senzorjev ali obližev za zdravljenje kroničnih ran.
Viri
Vilnius-Lithuania. Vilnius University. SYNHESION - natural bacterial adhesives. 2024. Dostopno na: https://teams.igem.org/5246 (17.05.2025)
