Verižna reakcija s polimerazo

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Verižna reakcija s polimerazo (angl. PCR, polymerase chain reaction) je metoda molekularne biologije, s katero pomnožimo točno določen fragment DNA. Je enostavna in hitra metoda za številno replikacijo fragmentov DNA. Metodo je leta 1983 razvil ameriški biokemik Kary Mullis.

Contents

Postopek

Verižna polimerizacija vklučuje tri osnovne korake slika1: 1. Denaturacija genskega materiala – Z segrevanjem na 90-96°C za 20-30 sekund povzročimo razpad vodikovih vezi v dvojni vijačnici ter s tem dobimo enoverižno DNA. 2. Prileganje – Z znižanjem temperature (na 37-55°C) omogočimo povezavo med začetnimi oligonukleotidi in matrico. 3. Sinteza s polimerazo – DNA-polimeraza prebere določen del verige in ga hitro primerja s komplementarnimi nukleotidi. Rezultat sta dva nova heliksa na mestu prvega. Celotna PCR zahteva le vir toplote, encim, raztopino soli in gradnike DNA. Za vsakego od teh korakov je optimalna temperatura različna, vendar naprave danes že avtomatično kontrolirajo temperaturne spremambe. Da dobimo več DNA, proces le ponovimo. Vsak cikel traja le 1-3min, torej nam ponavljanje procesa 45min lahko teoretično da milijone kopij specifičnega DNA niza. S PCR pa so se pojavili tudi nakateri tehnični problemi. Kontaminacija vzorca s tujim dednim materialom, ki lahko razmoži številne kopije nerelevantne DNA. Rezultat je pogosto neuporaben, včasih pa lahko pripelje do zmotnih zaključkov. Ključnega pomena za proces avtomatizacije je bila Taq polimeraza (Taq je okrajšava za Thermus aquaticus, bakterija ki preživi in se razmožuje v okolju, ki je za druge organizme smrtno). V nasprotju z drugimi polimerazami je encim, ki izvira iz Taq, stabilen pri visokih temperaturah. Tako z uporabo termostabilne polimeraze ni več potrebno dodajanje novega encima v vsakem ciklu. PCR izvajamo v natančnih termostatih slika2, ki jim lahko določamo temperaturo, čas inkubacije,število ponovitev ciklov,... Pri klasični izvedbi po končani reakciji produkte analiziramo z elektroforezo v agaroznem gelu.

Uporaba verižne polimerizacije

PCR je zelo hitro postal bistvenega pomena za zdravje ljudi. Uporaba verižne polimerizacije v medicinskih raziskavah in v klinični medicini se najbolj kaže pri odkrivanju organizmov, ki povzročajo infekcije in pri odkrivanju variacij in genskih mutacij(predvsem pri ljudeh). Zdravniki in raziskovalci lahko preiskujejo eno spolno celico, saj PCR lahko prepiše nepredstavljivo majhne količine DNA. Ta metoda je uporabna za ugotavljanje organizmov, kot so različne vrste bakterij, gliv in virusov, saj lahko razmnoži majhne količine genetskega materiala nekega organizma, ki daje zmožnost identifikacije. Z njeno pomočjo, kot primer, odkrijejo virus HIV že v prvih tednih od infekcije. PCR je natančnejša kot standardni testi. S pomočjo te tehnike je bila odkrita bakterijska DNA v srednje ušesni tekočini, ki je kazala na aktivno infekcijo, katere pa druge metode niso odkrile. Metoda verižne polimerizacije je pripeljala do novih vrst genetskega testiranja, saj lahko loči že zelo majhne variacije v DNA.

Forenzika

Iskanje prstnih odtisov DNA prihaja v široko uporabo. Biokemijsko analizirajo DNA iz bioloških vzorcev, ki jih najdejo na kraju zločina. S tem razkrijejo genetske značilnosti posameznika.

  • Polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov

Je ena prvih metod, ki so jo v forenziki uporabili. Najprej razgradijo vzorec DNA z restrikcijskimi encimi. Fragmente DNA nato ločijo z gelsko elektroforezo, prenesejo na membrano, hibridizirajo z DNA sondo in analizirajo z avtoradiografijo.

  • Analize na osnovi PCR

Pri tej metodi uporabijo DNA, pomnoženo s PCR. Kot sonde za hibridizacijo na komplementarna zaporedja uporabljajo alelno-specifične oligonukleotide. Za razliko od prve metode je hitrejša, enostavnejša, delo pa poreka brez radioaktivnih sond. DNA lahko analiziramo iz enega samega lasu ali izredno majhne vzorce krvi, sline ali semena.

Viri

Personal tools