Zasnova in karakterizacija s salicilno kislino induciranega genskega ekspresijskega sistema za celice Jurkat
Uvod
Genski regulativni sistemi, ki ponujajo zanesljiv in predvidljiv nadzor nad gensko ekspresijo v sesalskih celicah, imajo široke aplikacije, ki vključujejo osnovno biološko odkritje, epigenetsko preoblikovanje in izvajanje terapevtskih nalog. Za uporabo v T-celicah so zanimivi sistemi za ekspresijo genov, ki jih inducirajo zdravila. Posebej zasnovane T-celice so uporabne za zdravljenje številnih hematoloških malignomov, vendar je njihov terapevtski učinek omejen s tveganjem življenjsko nevarnih zapletov, kot sta sindrom sproščanja citokinov (CRS) in sindrom encefalopatije, povezane s CAR T-celicami (CRES) [1].
Celice Jurkat so nesmrtna linija človeških limfocitnih celic T, ki se uporabljajo za preučevanje akutne T celične levkemije, signalizacijo T celic in izražanja različnih kemokinskih receptorjev, občutljivih na viruse, zlasti HIV. Za regulacijo tarčnih genov v Jurkat celicah je bilo razvitih tudi več platform, ki jih inducira tetraciklin (na osnovi TetR). Vendar pa lahko antibiotiki, vključno s tetraciklini, povzročijo spremembe v obnašanju celic, njihova stalna administracija pa lahko vodi infekcije z mikroorganizmi, ki so odporni na antibiotike. Prehrambeni in kozmetični aditivi so privlačen razred malomolekularnih induktorjev z ugodnimi varnostnimi profili. Izdelani transkripcijski sistemi, ki niso človeškega izvora in zato niso nagnjeni k interferenčnim vplivom z endogenimi signali, so dragoceni za aplikacije sintezne celične in genske terapije. Poleg tega sočasna, neodvisna in inducibilna ekspresija več genov verjetno zahteva izvajanje več ortogonalnih načinov nadzora. Zato je pomembno razviti dodatne sisteme za regulacijo genov za celice sesalcev, da bi razširili nabor orodij za sintezno biologijo in potencialno obravnavali omejitve obstoječih orodij za klinične aplikacije [1, 2].
Salicilna kislina (SA), imenovana tudi 2-hidroksibenzojska kislina ali o-hidroksibenzojska kislina, je v rastlinskem kraljestvu zelo razširjena v obliki estrov. Je naravna bioaktivna spojina in hormon, ki sodeluje pri imunskem odzivu rastlin. SA in sorodni derivati, kot je acetil-SA (aspirin), so znani po svojih analgetičnih, antipiretičnih in/ali protivnetnih učinkih pri ljudeh. Salicilati so poceni, zlahka dostopni brez recepta in varni pri uporabi v terapevtskih odmerkih (1,1 – 2,2 mM). V študiji opisujejo zasnovo SA-inducibilnega transgenskega ekspresijskega sistema neposredno v celicah Jurkat z uporabo lentivirusne transdukcije [1, 3].
Potek raziskave
Gensko stikalo, ki ga inducira salicilna kislina, temelji na proteinu MarR ("multiple antibiotic resistance repressor protein”) iz Escherichia coli. Gen marR kodira represor operona marRAB, regulativnega lokusa, ki nadzoruje večkratno odpornost na antibiotike v tem organizmu. MarR je avtorepresor, ki običajno vzdržuje izražanje mar operona na nizki ravni in zavira transkripcijo tako, da veže (kot homodimer) DNA operatorja marO1 in marO2. V prisotnosti induktorjev, kot je salicilat (SAL), se represor MarR sprosti z operona, kar ima za posledico povečane ravni MarA in posledično povečano odpornost na antibiotike [1, 4].
Izbira optimalnega zaporedja operatorskih mest
marO1 in marO2 vsebujeta isto palindromsko ponovitev (5′-TTGCC-3′), vendar imata različna zaporedja na obeh straneh. Da bi raziskali optimalno postavitev operatorskih mest, so najprej zasnovali različne GFP ekspresijske plazmide, ki jih regulira MarR. Vsak konstrukt je vseboval promotor lacUV5, ki mu je sledila ena od treh različnih kombinacij operatorjev: marO1-marO2, marO1-marO1 ali marO2-marO2. lacUV5 je mutiran promotor iz lac operona E. coli. lacUV5 je zelo podoben klasičnemu lac promotorju, saj vsebuje le 2 mutaciji baznih parov v -10 heksamernem območju in je med najpogosteje uporabljenimi promotorji v molekularni biologiji, saj ne potrebuje dodatnih aktivatorjev in povzroči visoke ravni genske ekspresije. Izmerili so, do kolikšne mere pride do represije fluorescence z in brez SA pri E. coli (sev JW5248–1). Medtem ko so bile podobne ravni fluorescence GFP opažene za vse tri konstrukte, je kombinacija marO1-marO2 pokazala največjo represijo (najnižja fluorescenca GFP v ozadju brez induktorja). Zato so izbrali zaporedje operaterjev marO1-marO2 za inženiring SA-inducibilnega promotorja za Jurkat celice [1].
Zasnova vezja
Za testiranje MarR-reguliranega SA-inducibilnega (SAON) sistema v celicah Jurkat so razvili dvokomponentno vezje za represijo transkripcije, ki ga je navdihnil sistem ekspresije sesalcev, ki temelji na TetR. Prvo komponento je sestavljal reporterski konstrukt lentivirusnega vektorja, ki je vseboval zaporedje marO1-marO2 za močnim promotorjem človeškega elongacijskega faktorja 1 alfa (EF-1α), ki nadzoruje ekspresijo gena, ki kodira EGFP (izboljšan GFP). EF-1α je konstitutivni promotor človeškega izvora, in se pogosto uporablja v pogojih, ko imajo drugi promotorji (kot je CMV) zmanjšano aktivnost ali so bili utišani (na primer v embrionalnih matičnih celicah). Drugo komponento sistema je predstavljal drugi lentivirusni vektor, ki je vseboval konstrukt NLS-MBP-hMarR (konstrukt, ki kodira MarR, optimiziran za človeški kodon, spojen z jedrskim lokalizacijskim signalom (NLS) iz SV40 in domeno proteina, ki veže maltozo (MBP), oba na N-terminusu) pod nadzorom promotorja človeške fosfoglicerat kinaze-1 (PGK-1). Tako je dosežena bila funkcionalna ekspresija MarR v celicah Jurkat. Uporabili so domeno MBP, saj povečuje funkcionalno, heterologno izražanje proteinov v sesalskih celicah. Poliklonska populacija celic Jurkat, ki stabilno nosi te ekspresijske konstrukte represorja in reporterja, je bila tako ustvarjena z zaporednim, dvostopenjskim pristopom lentivirusne transdukcije [1, 5].
Rezultati
Profile genske ekspresije celičnih podklonov, ki nosijo enojni reporter ali dvojni reporter + represorski konstrukti, so ocenili po 24-urni inkubaciji pri različnih koncentracijah SA, do največje fiziološko sprejemljive koncentracije (0, 0,5 mM, 1 mM in 2 mM). Enojni reporterski konstrukt je pokazal robustno konstitutivno ekspresijo EGFP ne glede na ravni SA, kar ponazarja funkcionalni promotor EF-1α v celicah Jurkat. Nasprotno pa so celice s konstruktom reporter + represorja pokazale znatno zmanjšano izražanje EGFP v odsotnosti induktorja, kar je pokazalo transkripcijsko represijo promotorja EF-1α s strani MarR v Jurkat celicah. Po dodajanju progresivno višjih koncentracij SA se ekspresija EGFP v celicah, ki nosijo reporter + represorski konstrukt, ustrezno poveča, kar povzroči skupno 1,3-kratno indukcijo izražanja med 0 in 2 mM SA. Porast fluorescence se pri 2 mM SA ni ustavila, in je lahko indukcija večja pri višjih koncentracijah SA, vendar pa pride do spremembe v celični morfologiji in hitro zmanjšane sposobnosti preživetja celic v prisotnosti koncentracije SA, ki je višja od 2 mM. Čeprav je dinamični razpon nizek, je to prva predstavitev sistema SA-inducibilnega sistema, ki se neposredno uporablja v človeških T celicah. Regulacija, ki temelji na MarR v Jurkat celicah in drugih celicah sesalcev, ima potencial za različne izboljšave, na primer z načrtovanjem in izvajanjem variant MarR, ki imajo večjo občutljivost na SA, nadaljnjo optimizacijo promotorjev, uvedbo ojačevalcev transkripcije in translacije ter načrtovanje fuzij s transkripcijsko domen za utišanje ali aktivacijo [1].
Zaključek
V zadnjih letih so bili zasnovani različni sistemi za regulacijo sintetičnih genov, ki zagotavljajo nastavljiv nadzor nad transkripcijo tarčnih genov. Razvoj takšnih sistemov z visoko specifičnostjo (ortogonalnost in minimalni učinki zunaj cilja) in strogo regulacijo (nizko ozadje in širok dinamični razpon) je bistvenega pomena za večino aplikacij. Prenos orodij za regulacijo genov na celice sesalcev se sooča z izzivi funkcionalne in ustrezne heterologne ekspresije. V pogosto "problematičnih" primarnih ali imunskih celicah je ta izziv dodatno otežen s problemi, povezanimi z ohranjanjem genskih regulativnih zmogljivosti heterolognih regulativnih elementov. Načrtovanje ekspresijskih sistemov neposredno v T-celicah se izogne potencialnim pastem, na katere naletimo, ko se ti prvič razvijejo v nadomestni celični liniji, preden se prenesejo v T-celice. Tu se je pokazalo, da protein MarR iz E. coli ohranja represivno funkcijo in zagotavlja določeno raven regulacije izražanja tarčnih genov v Jurkat celicah z nadzorom razpoložljivosti SA. Medtem ko je inducibilnost pri trenutnem konstruktu nizka, je to verjetno posledica nezadostne sprostitve represorja, kar je posledično omejeno s toksičnostjo SA. To je mogoče premagati z inženiringom različice MarR, ki je bolj občutljiva na SA, ali s testiranjem uporabe alternativnih, manj toksičnih induktorjev, za katere je znano, da neposredno vplivajo na funkcijo MarR. Alternativne zasnove je mogoče sprejeti tudi za izboljšanje dinamičnega razpona, na primer z optimizacijo promotorja ali z izvajanjem negativne povratne informacije [1].
Viri
[1] Doshi, A., Bandey, I., Nevozhay, D., Varadarajan, N., Cirino, P. C. (2022). Design and characterization of a salicylic acid-inducible gene expression system for Jurkat cells. Journal of Biotechnology, 346, 11-14, doi:https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2022.01.003
[2] Abraham, R. T., & Weiss, A. (2004). Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology, 4(4), 301–308. doi:10.1038/nri1330
[3] Boullard, O., Leblanc, H., & Besson, B. (2000). Salicylic Acid. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. doi:10.1002/14356007.a23_477
[4] Sulavik, M. C., Gambino, L. F., & Miller, P. F. (1995). The MarR repressor of the multiple antibiotic resistance (mar) operon in Escherichia coli: prototypic member of a family of bacterial regulatory proteins involved in sensing phenolic compounds. Molecular medicine (Cambridge, Mass.), 1(4), 436–446.
[5] Wang, X., Xu, Z., Tian, Z., Zhang, X., Xu, D., Li, Q., Zhang, J., & Wang, T. (2017). The EF-1α promoter maintains high-level transgene expression from episomal vectors in transfected CHO-K1 cells. Journal of cellular and molecular medicine, 21(11), 3044–3054. https://doi.org/10.1111/jcmm.13216
