Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE
UVOD IN MODELI MINIMALNIH CELIC
Eden izmed največjih izzivov sintezne biologije je razvoj sinteznega celičnega sistema – minimalne celice, ki bi se lahko avtonomno podvajala. Sintezni biologi so do danes razvili več celičnih modelov, ki naj bi zadoščali kriteriju avtonomnega podvojevanja [1]. Eden izmed njih je RNA celica, ki temelji na dveh katalitičnih RNA molekulah (ribocimih), zapakiranih v lipidni vezikel. Ta model temelji na posnemanju zgodnjega življenja na Zemlji, saj znanstveniki menijo, da je prva 'celica' vsebovala le molekulo RNA, ki je hkrati služila kot zapis genetske informacije in encim, ki to genetsko informacijo procesira in omogoča potek metabolizma. Težava modela RNA celice je, da zaenkrat še ne poznamo ribocima, ki bi bil sposoben uravnavati samopodvojevanje ali sintezo membranskih komponent iz osnovnih gradnikov [1, 2]. Drugi postavljen model minimalne celice je tako imenovana ribosomska celica. Taka celica sicer vsebuje veliko več komponent, kar pomeni, da gre za veliko bolj kompleksen sistem, vendar se zdi z današnjim znanjem bolj izvedljiva, še posebej po tem, ko so leta 2001 razvili sistem PURE – sistem za sintezo proteinov, ki temelji na osnovi rekombinantno pripravljenih elementov [1].
SISTEM PURE
Sistem PURE je sistem, ki omogoča in vitro sintezo proteinov. Od brezceličnih sistemov (npr. lizat zajčjih retikulocitov) se razlikuje po tem, da ne vsebuje nukleaz, proteaz, membranskih lipidov ali katerihkoli drugih komponent, ki vzorec kontaminirajo in vplivajo na učinkovitost sinteze proteinov [3]. Prvi PURE sistem so leta 2001 razvili Shimizu in sod. [4], od takrat pa se je na trgu že pojavilo nekaj izboljšav. V New England BioLabs so razvili sistem PURExpress [5], ki je varianta osnovnega PURE sistema, pri kateri so optimizirali koncentracije posameznih faktorjev v mešanici in s tem povečali produktivnost sistema. Ker se vse proteine, ki so del PURE sistemov, pripravlja rekombinantno in očisti prek nikelj-afinitetne kromatografije, kar pomeni, da imajo vsi proteini na N- ali C-koncu heksahistidinsko fuzijo, so v podjetju GeneFrontier razvili še sistem PUREfrex [6], ki se od PURExpress razlikuje le po tem, da po čiščenju proteinom heksahistidinsko oznako odstranijo, da ta slučajno ne bi zmanjšala učinkovitosti proteinov in s tem samega procesa translacije. PUREFrex2.0 pa je optimiziran sistem PUREfrex, ki omogoča večji izplen sinteze proteinov [1, 3].
SESTAVA SISTEMA PURE
Osnovne komponente sistema PURE so RNA polimeraza iz bakteriofaga T7, 70S ribosom iz E. coli, molekule tRNA, 31 translacijskih faktorjev ter pufer, ki vsebuje tRNA, NTP, aminokisline, DTT in številne druge komponente [3]. Celoten seznam je dostopen tukaj. Vse proteinske komponente sistema se pripravi rekombinantno, zato vsebujejo heksahistidinsko fuzijo, ki omogoči čiščenje prek nikelj-afinitetne kromatografije, ribosome pa se očisti prek kolonske kromatografije z reverzno fazo, ki ji sledi še ultracentrifugiranje [3].
RAZISKAVA
UVOD
Če bi želeli sistem PURE uporabiti v samopodvajajočih se celicah, se morajo s tem sistemom uspešno sintetizirati tudi proteini, ki so del samega sistema PURE. V raziskavi, ki jo bom v nadaljevanju predstavila so zato preverjali, kako uspešen je sistem PURE pri sintezi svojih lastnih proteinov. Že v prejšnjih raziskavah so sicer pokazali, da se lahko s tem sistemom sintetizira 19 od 20 aminoacil-tRNA sintetaz, in vseh 54 podenot ribosoma, a le, če se jih izraža posamično, ne pa tudi ob koekspresiji vseh podenot ribosoma hkrati [7].
V raziskavi so uporabili plazmid pTFM1, v katerega so bili vstavljeni zapisi za 32 proteinov (vsi translacijski faktorji razen EF-Tu). Ta v raziskavo ni bil vključen, ker so uporabili plazmid, ki ga je v preteklosti pripravila druga raziskovalna skupina. Ta se je odločila, da zapisa za EF-Tu ni smiselno vključiti v vektor, saj je v celici potreben v veliko višjih koncentracijah kot ostali translacijski faktorji [8]. Vsi konstrukti (32), ki so jih vstavili v vektor, so bili pripravljeni na enak način: začnejo se s promotorjem T7, ki mu je dodan operator laktoznega operona, sledi vezavno mesto za ribosom, zapis za protein, končajo pa se s terminatorjem phi iz faga T7.
Da bi lahko ločili proteine, ki jih sistem PURE vsebuje že na začetku in tiste, ki so nastali pri in vitro translaciji v sistemu PURE, so v pufer, ki je del sistema, namesto običajnih aminokislin dali 15N označene aminokisline. To pomeni, da so vsi novosintetizirani proteini vsebovali 15N, medtem ko so imeli proteini, ki so del samega sistema, v aminokisline vgrajen izotop 14N. V tako pripravljen sistem PURExpress oziroma PUREfrex2.0 so dodali plazmid pTFM1 po inkubaciji detektirali proteine, ki so se izrazili [1].
DOLOČANJE RELATIVNE JAKOSTI SINTEZE PROTEINOV
Sintetizirane proteine so najprej ločili s tekočinsko kromatografijo, jih tripsinizirali, nato pa analizirali na masnem spektrometru. Na ta način so lahko s primerjavo intenzitet vrhov težkih (15N) in lahkih (14N) oblik proteina po masni spektrometriji določili relativno jakost izražanja posameznega proteina. Pokazali so, da pride v obeh sistemih do sinteze vseh 32 proteinov, vendar je bil sistem PUREfrex2.0 v uporabljenih eksperimentalnih pogojih veliko učinkovitejši. Iz rezultatov so zaključili, da lahko s sistemom PURE sintetiziramo vse translacijske faktorje, razen elongacijskega faktorja Tu (EF-Tu) in vse aminoacil-tRNA sintetaze, tudi če so ti zapisani na enem samem vektorju. Velja pa, da se jakost translacije od proteina do proteina močno razlikuje [1].
FENOMEN IZGUBE PROCESIVNOSTI
Ker so pri analizi rezultatov opazili, da se količina fragmentov, ki izhajajo iz posameznega peptida (tripsinizacija) od N- proti C-koncu polipeptidne verige manjša, so raziskovalci sklepali, da pri sintezi nastane veliko skrajšanih (angl. truncated) proteinov, kar niža uporabnost samega sistema. Da bi preučili ta pojav, so se omejili na analizo 4 elongacijskih faktorjev. Poskus je potekal na enak način kot prej, le da so tokrat vzorce analizirali po različnih časih inkubacije. Iz primerjave intenzitet vrhov v masnem spektru, ki so pripadali peptidom sistemu PURE lastnih proteinov oziroma peptidom sintetiziranih proteinov, so ugotovili, da se pri nekaterih izmed proučevanih proteinih od N- proti C-koncu zmanjšuje razmerje intenzitet ne glede na čas sinteze tako v sistemu PURExpress kot tudi PUREfrex2.0. To pomeni, da prihaja do nepopolne sinteze novo nastajajočih proteinov oziroma, da je procesivnost pri translaciji okrnjena. Na podlagi dobljenih rezultatov so izračunali, da je povprečna izguba procesivnosti na kodon 3·10-3 za sistem PUREfrex2.0 oziroma 8·10-3 za sistem PURExpress, kar je vsaj red velikosti več kot pri E. coli [1].
V nadaljevanju je raziskovalce zanimalo, kaj je vzrok za izgubo procesivnosti. Glede na to, da je pojav prezgodnje zaustavitve translacije prisoten že na začetku reakcije, sklepajo, da izguba procesivnosti ni posledica pomanjkanja gradnikov s časom ali razgradnje mRNA. Da bi izključili možnost, da je izguba procesivnosti posledica uporabe v laboratoriju pripravljenega pufra, so vse poskuse ponovili še s komercialnim pufrom. Ugotovili so, da se procesivnost sistema PURExpress po zamenjavi pufra poveča, pri PUREfrex2.0 pa sprememb niso opazili. Iz tega so lahko zaključili, da sistem PURExpress ni slabši oziroma manj učinkovit od sistema PUREfrex2.0, kot je to nakazoval prvi poskus, je pa PURExpress bolj občutljiv na sestavo pufra [1].
ABSOLUTNA KVANTIFIKACIJA PROTEINOV
Ker na podlagi razmerja intenzitet vrhov neoznačenih in označenih proteinov ne moremo primerjati jakosti izražanja proteinov v sistemu PUREfrex2.0 in PURExpress niti jakosti izražanja različnih proteinov znotraj enega sistema, so za absolutno kvantifikacijo izraženih proteinov naredili še en poskus. Najprej so pripravili protein QconCAT–protein, pripravljen s konkatenacijo peptidnih fragmentov, ki so jih v prejšnjih poskusih uporabili kot referenčne standarde pri relativni kvantifikaciji posameznih peptidov v vzorcu. S pomočjo QconCAT so lahko določili absolutno koncentracijo vseh izraženih proteinov. Ugotovili so, da se proteini izražajo v zelo velikem razponu koncentracij. Med koncentracijami proteinov v enem sistemu je več redov velikosti razlike (povprečno 0,2 µM koncentracija, le redki dosežejo koncentracije nad 1 µM), prav tako prihaja tudi do velikih razlik v koncentracijah med obema proučevanima sistemoma PURE. Dobljene podatke so nazadnje primerjali z računalniškimi napovednimi orodji in ugotovili, da med obema setoma podatkov ni nobene korelacije. Za konec so primerjali še koncentracijo vhodnega proteina in koncentracijo sintetiziranega proteina, pri čemer so se osredotočili na kvantifikacijo C-končnih fragmentov posameznih proteinov, saj je le v primeru, da je prisoten tudi C-končni fragment, protein sintetiziran v celoti. Iz rezultatov so zaključili, da se lahko v sistemu PUREfrex2.0 sintetizira vsaj polovica proteinov v koncentracijah, ki so višje od vhodnih (prisotnih v sistemu na začetku), sistemu pri PURExpress pa je učinkovitost veliko manjša, pri čemer je potrebno poudariti, da je izguba procesivnosti v obeh sistemih enaka [1].
POVZETEK
Če želimo razviti samopodvajajoče se minimalne celice, morajo biti te sposobne pomnoževati svojo lastno translacijsko mašinerijo. Raziskava je pokazala, da je to s sistemom PURE v principu mogoče, vendar smo trenutno še vedno omejeni s slabo procesivnostjo translacije (do 50x slabša kot pri E. coli). Zmanjšana procesivnost v primerjavi z obstoječimi celicami bi lahko bila posledica destabilizacije ali zaustavitve ribosomov, znižanja koncentracije aminoacil-tRNA ali prezgodnje terminacije sinteze proteinov. Težavo bi lahko rešili, če bi v sistem PURE dodali ribosomalne stabilizacijske faktorje (npr. EF-G), če bi optimizirali sestavo sistema PURE (prilagodili koncentracije posameznih komponent) ali pa optimizirali sestavo pufra [1].
Trenutno je biosintezna zmogljivost sistema PURE 10 – 100x nižja kot bi jo potrebovali za sintezo minimalne celice, verjamem pa, da lahko z optimizacijo sistema dosežemo potrebne koncentracije, da bo ideja o samopodvajajoči se minimalni celici slej kot prej zaživela in nam bo nudila izhodišče za pripravo kompleksnih in izjemno uporabnih sinteznobioloških sistemov.
VIRI IN LITERATURA
[1] A. Doerr, D. Foschepoth, A. C. Forster in C. Danelon: In vitro synthesis of 32 translation-factor proteins from a single template reveals impaired ribosomal processivity. Sci. Rep. 2021, 11(1), 1898–.
[2] J. W. Szostak, D. P. Bartel, in P. L. Luisi: Synthesizing life. Nature. 2001, 409(6818), 387–390.
[3] Y. Kuruma in T. Ueda: The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins. Nat. Protoc. 2015, 10 (9), 1328–1344.
[4] Y. Shimizu et al.: Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechnol. 2001, 19(8), 751–755.
[5] PURExpress® In Vitro Protein Synthesis Kit | NEB. [internet]. [1. 4. 2021]. Dostopno na: https://international.neb.com/products/e6800-purexpress-invitro-protein-synthesis-kit#ProductInformation.
[6] Overview | PUREfrex® | GeneFrontier Corporation. [internet]. [1. 4. 2021]. Dostopno na: https://purefrex.genefrontier.com/overview/PUREfrex.html.
[7] T. Awai, N. Ichihashi, in T. Yomo: Activities of 20 aminoacyl-tRNA synthetases expressed in a reconstituted translation system in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Reports. 2015, 3, 140–143.
[8] T. R. Shepherd et al.: De novo design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Res. 2017, 45(18), 10895–10905.
