Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje

Uvod

LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.

Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.

Mehanizem retrotranspozicije LINE-1

Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.

Regulacija aktivnosti LINE-1

Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.

Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji

V predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 v tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.

Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA v predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena v stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže v stopnji osemceličnega zarodka.

Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je v predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.

Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.

N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.

Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).

Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah

Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo.

Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri Drosophila melanogaster (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.

Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.

Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.

Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka

Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.

Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.

Viri

[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.

[2] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.