Dolge in kratke nekodirajoče RNA

Pred več kot 50 leti odkrita centralna dogma molekularne biologije je kmalu začela kazati svoje pomanjkljivosti; znanstveniki so namreč odkrili (in še vedno odkrivajo) številne RNA, ki ne kodirajo za proteine. Poimenovali so jih nekodirajoče RNA. Danes jih delimo na kratke in dolge nekodirajoče RNA; meja v dolžini transkripta je pri 200 nukleotidih. Kratke nekodirajoče RNA, med katere spadata majhna interferenčna RNA oz. siRNA in mikroRNA (miRNA), igrajo pomembno vlogo v številnih bioloških procesih.

Dolge nekodirajoče RNA

Večina nekodirajočih RNA pa spada med dolge nekodirajoče RNA. Tudi te so udeležene v številnih različnih procesih, kot so npr. inaktivacija X-kromosoma, vtisnjenje genov, regulacija celičnega cikla in apoptoze ter modifikacija kromatinske strukture, medtem ko je njihova skupna značilnost to, da omogočajo izgradnjo ribonukleoproteinskih kompleksov, ki globalno uravnavajo izražanje genov. Zaradi velikega števila dolgih nekodirajočih RNA je potrebna sistematika pri razvrščanju; ena od možnosti je, da jih razvrstimo na podlagi primerjave njihove lokacije in lokacije protein kodirajočih genov. Tako dobimo 4 tipe dolgih nekodirajočih RNA:

• smerna RNA (njeno zaporedje delno prekriva protein kodirajoči gen in se lahko nahaja na področju eksonov ali popolnoma znotraj nekega introna);
• protismerna RNA(tako zaporedje se nahaja na komplementarni verigi DNA, vendar še vedno na področju protein kodirajočega gena),
• dvosmerna RNA (ta se ravno tako nahaja na komplementarni verigi DNA, a je od protein kodirajočega gena oddaljena do 1000 nukleotidov)
• intergenska RNA (njeno zaporedje se nahaja na področju, kjer v bližini ni nobenih genov).

Za dolge nekodirajoče RNA je značilno, da so bolj izpostavljene evolucijskemu pritisku kot protein kodirajoči geni, zato so v splošnem njihova nukleotidna zaporedja manj ohranjena kot v primeru proteinov. Poleg že omenjenih funkcij so dolge nekodirajoče RNA pomembni mediatorji pri rakavih obolenjih; pokazano je bilo, da prisotnost dolge nekodirajoče RNA z imenom HOTAIR napoveduje metastazo tumorjev, za neko drugo RNA z imenom PANDA pa, da inhibira t.i. p53 posredovano apoptozo, zaradi česar se rakave celice nenadzorovano delijo.

Regulacija izražanja genov

Odkrito je bilo, da lahko lncRNA delujejo po različnih mehanizmih. Delitev na skupine še ni enotna, zato lahko v člankih različnih avtorjev zasledimo različne razdelitve. Nekatere molekule lncRNA lahko spadajo tudi v več izmed skupin. V glavnem pa jih ločimo glede na proces, na katerega vplivajo.

Regulacija na ravni epigenetike

Najbolj raziskan vpliv lncRNA na regulacijo izražanja genov je preko epigenetskih modifikacij histonov. Načini delovanja lncRNA so naslednji:

Adapter (angl. scaffold): LncRNA lahko združi več kromatin-preoblikovalnimih kompleksov (KPK) na enem mestu. Med KPK, ki utišajo izražanje genov, uvrščamo PRC1 in PRC2 (angl. Polycomb repressive complex), ki di- in trimetilirirata lizin 27 na histonu 3 (H3k27me2 in H3k27me3) in G9a, ki to počne na lizinu 9 istega histona (H3K9me2 in H3K9me3). LncRNA kot sta to HOTAIR in Kcnq1ot1 lahko sočasno nase vežeta dva takšna proteina in s tem povečata učinek utišanja. Klasičen primer adapterja naj bi bila kar ncRNA v telomeraznem kompleksu imenovana TERC, ki pa seveda ne združi KPK ampak različne proteinske podenote telomeraz.

Usmerjevalnik (angl. guides): LncRNA služijo tudi kot pomembni usmerjevalci KPK do specifičnih genomskih lokacij.. Na tarčno zaporedje DNA se vežejo direktno v obliki DNA:RNA trimera (redkeje) ali posredno preko DNA-vezavnih proteinov, včasih pa vplivajo kar v neposredni okolici njihovega gena. Veliko katalitičnih članov KPK nima DNA- ampak RNA-vezavno domeno, zato domnevajo, da asociacija z določeno lncRNA determinira njihovo mesto delovanja. Na primer, asociacija PRC2 z Kcny1ot1 vodi do utišanja v Kcnq1 gruči genov, asociacija PRC2 z Xist do inaktivacije X kromosoma, med tem ko pride zaradi združenja PRC2 s HOTAIR do utišanja lokusa HOXD (metastazni supresorski geni).

• Pri zadnjem primeru se HOTAIR prepiše z HOXS lokusa 12. kromosoma in se nato združi skupaj z PRC2 in še LSD1 (ta izvede H3K4 demetilacijo). HOTAIR:PRC2:LSD1 kompleks se nato prestavi k HOXD lokusu 2. kromosoma in tam izvede H3K27 metilacijo in H3K4 demetilacijo ter s tem utiša izražanje genov. Primer je zlasti poučen, saj je povečana izraženost HOTAIR dober napovednik potencialnih metastaz rak in kaže na to, da bi lahko v prihodnosti lncRNA uporabljali tudi kot markerje bolezni.
• Poglejmo si še primer, ko lncRNA poveča izraženost genov, nasprotno kot v zgorah opisanih primerih. LncRNA HOTTIP je zapisan na 5' koncu gruče genov HOXA (še bolj navzgor od ojačevalnega zaporedja). Nascenten HOTTIP veže enega izmed proteinov WAR kompeksa (WDR5), ki je asociiran še z proteinom MLL (metil transferaza). Zaradi upogiba kromosoma, celoten kompleks pride v bližino HOXA genov. Tam MLL poskrbi za metilacijo lizina H3K4me3 in v nasportju s pričakovanji omogoči zrahljanje strukture kromatina. S tem je omogočen dostop RNA polimerazi II in izražanje genov HOXA.

Regulacija na nivoju transkripcije

Številni primeri so pokazali, da lahko lncRNA, ki se sicer pogosto prepiše iz ojačevalnih mest, deluje na le te. Na ojačevalec se lahko veže molekula lncRNA, ali pa vzpodbudi vezavo kakega drugega proteina na to mesto (npr. proteinskega kompleksa - mediatorja). Kljub temu da je mehanizem delovanja pri večih primerih zelo podoben, ni bila odkrita nobena podobnost v zaporedju teh molekul. Pri tem je potrebno pozornost posvetiti tudi sekundarnim strukturam. lncRNA lahko asociirajo z DNA-vezavnimi proteini in preprečijo njihovo vezavo na DNA. Tumor supresor protein p53 se med drugim aktivira ob poškodbah DNA in lahko vodi v celično apoptozo ali zastavitev celičnega cikla (preko p21). Pro-apoptotske gene (npr. FAS in APAF1) lahko aktivira le tako, da se veže z transkripcijskim faktorjem NF-Y. Hkrati p53 zraža še lncRNA imenovano PANDA. Ta je prav tako zmožna asociacije z NF-Y in s tem, ko jih veže nase, prepreči p53, da bi izrazil pro-apoptotske gene. PANDA tako deluje kot posrednik med celično smrtjo in zaustavitvijo celičnega cikla. Njeno utišanje in vitro zato vodi do povečane apoptoze celic.

Regulacija na nivoju post-transkripcije

Delovanje lncRNA lahko poteka tudi na nivoju post-transkripcijske regulacije. Molekula lncRNA se veže na mesto izrezovanja intronov, zaradi česar pride do alternativnega izrezovanja. Lahko pride tudi pospešenega nalaganja polisomov na molekulo mRNA, kar vidimo po tem, da nastane več produkta pri isti količini mRNA. Mehanizmi so še precej neraziskani in se z odkrivanjem novih primerov čedalje bolj pojasnjujejo.

lncRNA kot sporočevalci

Zanimivo je tudi odkritje, da se lncRNA nahaja v eksosomih. To so majhni vezikli, ki se nahajajo ob membrani, in se ob stiku prenesejo v sosednjo celico. Vsebina eksosomov se prenese v sosednjo celico, s čimer lahko vpliva na potek procesov v njej. Predvideva se, da bi lahko nekodirajoče molekule RNA delovale kot sporočevalci, vendar pa ta hipoteza še ni podprta z dokazi.

Kratke nekodirajoče RNA

Poleg dolgih nekodirajočih molekul RNA pa poznamo tudi kratke nekodirajoče. Teh je več vrst in jih zaradi različnih lastnosti delimo po skupinah. Sem spadajo miRNA, piRNA, siRNA, tasiRNA, rasiRNA, crRNA… Imajo različne funkcije delovanja; ne samo regulacija genov, temveč tudi npr. obramba celice. Pogosto se povežejo s proteini, tako da služijo kot kofaktorji, delujejo pa lahko tudi na podobne načine kot dolge kodirajoče RNA. So prav tako kot lncRNA še slabo raziskane.

Ugotavljanje funkcij in iskanje novih lncRNA

Za razumevanje delovanja dolgih nekodirajočih RNA se v zadnjem času uporabljajo bioinformatske metode, ki med sabo primerjajo tiste nekodirajoče RNA in proteine, ki se usklajeno izražajo. Na osnovi znane funkcije proteina se nato skuša napovedati funkcijo neke RNA; ta se potem potrdi z izbijanjem dolgih nekodirajočih RNA. Bodoče študije na tem področju se bodo ukvarjale s pridobivanjem novih primerov lncRNA. Razvoj metod je omogočil hitro odkrivanje novih zaporedij, vendar pa so dolgotrajnejše raziskave o njihovem pomenu. Želja znanstvenikov je odkriti biološko pomemben primer, ki bo dobro reguliran in bo ključno vplival na delovanje celice ali skupine celic.

Viri

• Yang, L., Froberg, J. E. in Lee, J. T. Long noncoding RNAs: fresh perspectives into the RNA world. Trends in Biochemical Sciences, 2013, letnik 39, št. 1, str. 35-43.
• Gibb, E. A., Brown, C.J. in Lam, W. L. The functional role of long non-coding RNA in human carcinomas. Molecular Cancer, 2011, letnik 10, št. 38.
• Flynn, R. A. in Chang, H. Y. Active chromatin and noncoding RNAs: an intimate relationship. Current Opinion in Genetics & Development, 2012, letnik 22, št. 2, str. 172-178.
• Rinn, J. L. in Chang H.Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annual Review of Biochemistry, 2012, letnik 81, str. 145-166.
• Geisler S. in Coller. J. RNA in unexpected places: long non-coding RNA functions in diverse cellular contexts. Nature reviews: molecular cell biology, 2013, letnik 14, št. 11, str. 699-712.
• Yan, B. in Wang Z. Long noncoding RNA: Its Physiological and Pathological Roles. DNA and Cell Biology, 2012, letnik 31, str. 34-41.