Inhibitorji podenote 50 S ribosoma

Inhibitorji podenote 50 S ribosoma so antibiotiki, katerih tarča je velika podenota bakterijskih 70 S ribosomov. Njihovo delovanje temelji na inhibiciji procesa prevajanja mRNA, na tak način torej preprečijo sintezo proteinov, nujnih za bakterijsko delovanje. Družine 50 S inhibitorjev so naslednje: makrolidi, linkozamidi, streptogramini, amfenikoli in oksazolidinoni. Razlikujemo dva načina delovanja, in sicer nekateri preprečujejo podaljševanje polipeptidne verige, drugi pa inhibirajo vezavo tRNA na mesto A v ribosomu. Tudi proti inhibitorjem podenote 50 S bakterije razvijajo odpornost, zato se razvijajo novi načini inhibicije podenote 50 S. V nadaljevanju so najprej opisani primeri treh različnih mehanizmov delovanja inhibitorjev podenote 50 S ribosoma.

Makrolidi

Je družina naravno pridobljenih antibiotikov, katere strukturna značilnost je osrednji makrociklični laktonski obroč. So predominantni za grampozitivne bakterije (makrolidi so velike molekule), a delujejo tudi proti nekaterim gramnegativnim. Njihova pomembna značilnost je, da se reverzibilno vežejo na 23S rRNA, in sicer na nukleotid A2058 (številčenje po E. coli). Nekateri delujejo celo z vezavo na predhodne komponente podenote 50 S. Vrsta makrolidskega antibiotika je eritromicin, izoliran že leta 1949. Ta prepreči peptidil transferazno aktivnost 23S rRNA. Eritromicin namreč zasede tunel, skozi katerega izhaja nastajajoča polipeptidna veriga. Ta se tako ne more prenesti s tRNA na mestu P na aminoacil-tRNA na mestu A. Prevajanje mRNA zastane po nastanku 6 do 8 aminokislin dolgega polipeptida, kompleks ribosomskih podenot z mRNA pa razpade in rast bakterijskih celic se zmanjša. Makrolidi delujejo reverzibilno in so torej bakteriostatični (v višjih koncentracijah delujejo tudi baktericidno). Bakterijske celice lahko izražajo svojo odpornost že s prevajanjem specifičnih zaporedij nukleotidov na mRNA, kjer nastajajoči polipeptid med potjo skozi izhodni tunel iz ribosoma izrine makrolid.

Amfenikoli

Tako kot makrolidi so bili sprva pridobljeni na naravne načine. Osnovno strukturo predstavlja fenilpropanoid. Vpliv imajo tako na grampozitivne kot tudi na gramnegativne bakterije. Kloramfenikol se reverzibilno veže na nukleotida A2451 in A2452 molekule 23 S rRNA (t.j. peptidil transferazni center). Za razliko od eritromicina pa zavzame takšen položaj, da zasede prostor v mestu A. Tako prepreči vezavo aminoacil-tRNA na antikodon in onemogoči prevajanje mRNA. Na podoben način delujejo tudi linkozamidi. Kloramfenikol se uporablja predvsem pri zdravljenju nekaterih očesnih okužb in meningitisa (bakterije Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae idr.).

Oksazolidinoni

Osnovo strukturi daje 2-oksazolidon, nekateri oksazolidinoni pa lahko delujejo tudi kot antibiotiki. Eden od oksazolidinonov je linezolid, sintetično pripravljen antibiotik, učinkovit predvsem v boju proti nekaterim grampozitivnim bakterijam. Uporablja se redkeje, večinoma kadar nekateri drugi antibiotiki niso uspešni. Deluje v samem začetku prevajanja mRNA (iniciacija). Veže se na 23 S rRNA na peptidil transferazni center, toda še preden se sestavi kompleks 70 S ribosoma in mRNA. Strukturiran je na tak način, da zasede mesto A, ker pa se je vezal še pred začetkom prevajanja mRNA, zaustavi sam začetek prevajanja.

Odpornost na antibiotike

Bakterije so razvile več mehanizmov odpornosti proti antibiotikom – mutacija in encimska modifikacija tarče, t.j. proteinov in rRNA podenote 50 S ribosoma, encimska modifikacija antibiotika, sinteza črpalk za aktivno izčrpavanje antibiotika iz celice in druge. Tukaj se bomo osredotočili na mehanizme, ki omogočajo odpornost na zgoraj opisane skupine antibiotikov in njim sorodnim družinam antibiotikov kot so streptogramini in linkozamidi. Streptogramini in linkozamidi so skupine antibiotikov, ki se po strukturi razlikujejo od zgoraj opisanih makrolidov, vendar imajo podoben mehanizem delovanja. Njihova vezavna mesta na podenoti 50S ribosoma se namreč nahajajo blizu drug drugega ali pa se celo prekrivajo, zato pogosto razvoj odpornosti proti enemu izmed antibiotikov povzroči odpornost tudi proti antibiotikom drugih skupin.

Mehanizmi odpornosti

Mutacije 23 S rRNA

23 S rRNA je komponenta podenote 50 S ribosoma s peptidil transferazno aktivnostjo, hkrati pa predstavlja tarčo za vezavo večine antibiotikov skupine MLSb. Mutacije rRNA vplivajo na odpornost bakterij preko sprememb v vezavnem mestu, ki zmanjšajo afiniteto vezave antibiotikov na podenoto 50 S ribosoma. Ena izmed mutacij, ki povzroči odpornost bakterij na antibiotike skupin MLSb, je točkovna mutacija A2058G, kjer 2-amino skupina gvanina sterično ovira vezavo antibiotika na njegovo vezavno mesto. Ker je rRNA operon (rrn) v bakteriji prisoten v več kopijah, je za visoko odpornost potrebna mutacija vseh oz. večine 23 S rRNA alelov.

Mutacije proteinov podenote 50 S ribosoma

Mutacija genov rplV in rplD, ki zapisujeta za proteina L22 in L4 prav tako vpliva na bakterijsko odpornost proti MLSb antibiotikom. Proteina L22 in L4 s svojimi podaljšanimi zankami segata do peptidil transferaznega centra, L22 pa skupaj z domenami I-V 23S rRNA in drugimi proteini ribosoma tvorijo tunel za izhod nastajajočega proteina. Pri E.Coli mutirana oblika L4 zoži tunel za izhod in s tem onemogoči vezavo eritromicina, medtem ko mutirana oblika L22 (pri kateri pride do delecije zapisa za aminokislinske ostanke Met82, Lys83, Arg84) razširi tunel in omogoči nemoteno sintezo proteina kljub vezanemu eritromicinu.

Encimska modifikacija 23 S rRNA

Bakterije lahko razvijejo odpornost na antibiotike tudi prek metilacije A2058 23 S rRNA. Zapis za metilazo, ki katalizira reakcijo prenosa metilne skupine se nahaja na genu erm (eritromycin resistand methylase). Gen erm se običajno nahaja na plazmidih ali transpozonih, kar je eden od razlogov visoke razširjenosti različic tega gena med bakterijami različnih vrst. Ker metilacija A2058 omogoči bakterijsko odpornost na antibiotike skupine MLSb, hkrati pa zmanjša njeno sposobnost sinteze proteinov, poleg konstitutivno izraženih erm pogosto najdemo tudi inducibilno izražene različice, kot je ermC. Druga metilaza, odgovorna za odpornost proti kloramfenikolu in antibiotikom PhLOPS (Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins,Streptogramin A), je monometilaza Cfr. Cfr je bila prvič opisana leta 2000, leta 2005 pa je bila identificirana v mnogih patogenih sevih, tako grampozitivnih kot gramnegativnih bakterijah. Cfr metilira atom C8 nukleotida A2053 23 S rRNA in v nasprotju z Erm ne zmanjša sposobnosti bakterije za tvorbo proteinov. Mobilni genski elementi na katerih se nahaja cfr omogočajo hitro širitev odpornosti na zgoraj omenjene skupine antibiotikov.

Mehanizmi odpornosti, katerih tarča je antibiotik

Celice so razvile tudi druge mehanizme odpornosti, katerih tarča so molekule antibiotika. Poleg aktivnega črpanja antibiotika iz celice s pomočjo črpalk, so bakterije razvile mehanizme encimske modifikacije antibiotikov. Fosforilacija in glikolizacija sta učinkoviti proti delovanju makrolidov, acetilacija pa proti kloramfenikolu in streptograminom A. Acetilacijo antibiotika katalizirajo encimi CAT (chloramphenicol acetyltransferase). Geni cat se nahajajo tako na mobilnih genskih elementih kot tudi na samem kromosomu bakterij. Encime CAT razvrščamo v dve skupini, ki se med sabo razlikujejo v zaporedju aminokislinskih ostankov. Obema skupinama pa je skupna trimerna oblika encima z ohranjenim His v aktivnem mestu, ki je potreben za deprotonacijo hidroksilne skupine in prenos acetilne skupine iz acetil-CoA na antibiotik.

Prihodnost – novi antibiotiki, nove tarče

Zgoraj opisani mehanizmi odpornosti veljajo predvsem za antibiotike skupine MLSb in kloramfenikol. Leta 2001 je v klinično uporabo prišel antibiotik Linezolid iz skupine oksazolidinonov (prav tako inhibitorjev podenote 50 S ribosoma) na katerega opisani mehanizmi ne delujejo. Že leto po vstopu Linezolida na trg so znanstveniki identificirali na Linezolid odporen sev Stahpylococcus aureus, katerega odpornost lahko pripišemo mutaciji C2534U 23 S rRNA in mutaciji proteinov L3 in L4. Nadaljnje raziskave vezavnega mesta Linezolida in modifikacije že obstoječih antibiotikov vodijo v razvoj novih antibiotikov. V zadnjih letih se tako na različnih stopnjah kliničnih študij preizkušajo antibiotiki z izboljšano afiniteto na modificirane oz. mutirane tarče, večjo odpornostjo na encimsko modifikacijo in aktivno črpanje iz celice. Potencial za klinično uporabo imajo tudi antibiotiki naravnega izvora skupin ortosomicini in tiopeptidi, katerih tarča so H89 in H91 ter H43 in H44 zanke 23S rRNA, vendar pa je potrebno pred tem z modifikacijo molekul odpraviti težave s toksičnostjo oz. topnostjo teh potencialnih zdravil.

Viri

1. Weisblum, B. & Davies, J. Antibiotic inhibitors of the bacterial ribosome. Bacteriol. Rev. 32, 493–528 (1968).

2. Chellat, M. F., Raguž, L. & Riedl, R. Targeting Antibiotic Resistance. Angew. Chemie Int. Ed. 55, 6600–6626 (2016).

3. Munita, J. M. & Arias, C. A. in Virulence Mechanisms of Bacterial Pathogens, Fifth Edition 4, 481–511 (American Society of Microbiology, 2016).

4. Wilson, D. N. Ribosome-targeting antibiotics and mechanisms of bacterial resistance. Nat. Rev. Microbiol. 12, 35–48 (2013).