Kromosomske domene in kontrolne regije lokusov (LCR)

Uvod

Kromatin v jedru zavzema različne kompleksne strukturne in funkcionalne elemente, ki vplivajo na izražanje genov. Kmalu po Flemmingovem odkritju kromosomov so znanstveniki vse sile genetike in molekularne biologije uprli v razlago dejanskega zapisa genetskega koda. Danes pa se raziskave zopet usmerjajo v razlago zgradbe oziroma 3D strukture kromosomov. Zelo pomemben nivo kromatinske strukture so domene, znotraj katerih poteka regulacija izražanja genov preko kromatinskih zank, lokusov in njihovih kontrolnih regij. V seminarski nalogi bomo predstavili kromosomske domene in kotrolne regije lokusov ter primer regulacije izražanja genov za β-globin, ki je dobro raziskana.

Kromosomske domene

Ene izmed višjih strukturno-organizacijskih enot kromatina so kromosomske domene. Njihova velikost je v celicah zelo različna. Obsegajo lahko od nekaj kb do več Mb parov. Kromosomske domene so sestavljene iz lokusa, kromatinske zanke in ojačevalca. Vloga zanke je približevanje obeh elementov, zaradi česar se lahko začne transkripcija določenega gena. Lokus in ojačevalec sta specifična, kar pomeni, da se kromatinska zanka vedno tvori med določenim lokusom in njegovim ojačevalcem.

Najbolj uporabljena metoda za določanje strukture kromatina, ki se pogosto uporablja tudi za opazovanje kromosomskih domen in zank, je metoda 3C (chromosome conformation capture), ki ponavadi poteka v petih korakih. Najprej vzorcu preiskovanega kromatina dodamo formaldehid, ki kovalentno zamreži DNA s proteini in proteine med sabo. Nato dodamo presežek restrikcijskih encimov, ki ločijo delež zamreženega kromatina. Sledi ligacija in reverzno zamreženje pri visoki temperaturi, da dobimo ustrezna specifična restrikcijska mesta. Na koncu dobljene segmente DNA pomnožimo z metodo PCR, pri kateri začetnim oligonukleotidom dodamo določene sonde (taqman sonde), s katerimi nato zaznamo mesta kontakta in s tem organizacijo kromatina.

Lokus

Lokus je specifičen del na DNA, v katerem so koncentrirani določeni geni, ki se izražajo s pomočjo ene kontrolne regije lokusa (LCR). Lokus in njegovo kontrolno regijo so najprej raziskali pri β-globinu.

Zanka

Kromatinske zanke, ki so sestavni del kromosomskih domen, so strukture, ki povezujejo ojačevalec z lokusom oziroma z genom v njem. Ojačevalec in lokus sta ponavadi daleč narazen po zaporedju (lahko tudi do več 100 kb narazen) in zanka ju približa, da se transkripcija lahko začne. Zanke pa lahko na transkripcijo vplivajo tudi negativno. Primer takega delovanja pri človeku je starševsko vtisnjenje (modificiranje) pri izražanju gena za rastni faktor Igf1. Materin Igf1 gen, ki je utišan, se nahaja na neaktivni kromatinski zanki, ki preprečuje povezovanje njegovega promotorja z ojačevalcem. Gen H19 z istega lokusa je v tem primeru še vedno prepisno aktiven. Utišanje Igf1gena pa lahko poteka tudi preko posebnih kontrolnih regij z izolatorjem (ICR-imprinting control region), ki se vežejo na njegov promotor in ojačevalec.

Mehanizmi nastanka zank so zaenkrat slabo razumljeni. Predvideno je bilo, da pri nastanku zanke sodelujejo različni aktivatorski proteini. Aktivira jo protein GATA-1, ki homodimerizira na vsaki strani zanke. Ta mehanizem je posledica poskusa, pri katerem so našli GATA-1 vezan na promotor in regijo LCR. Obstajajo tudi drugi mehanizmi, ki pa niso potrjeni. Tudi neaktivna zanka nastane pod vplivom določenih proteinov (polycomb proteini), ki se vežejo na specifične regije na DNA (PRE-polycomb response elements).

LCR (Locus Control Regions)

Lokusne kontrolne regije so odseki na kromatinu, ki uravnavajo ekspresijo genov v evkariontskem genomu, delujejo namreč kot ojačevalec (enhancer) transkripcije ob vezavi določenih transkripcijskih faktorjev. Po načinu delovanja torej sodijo med cis-regulatorne elemente. Prve dokaze o obstoju tovrstnih regij so dobili ob študijah transgenskih miši, točneje gena za β-globin. Pri nekaterih linijah se namreč gen ni izražal (<1% normalnega) in je bil del transkripcijsko zavrtega heterokromatina, čeprav je bil ohranjen celoten lokus tega gena. Izrezano je bilo namreč približno 5kbp dolgo zaporedje 20kbp navzgor (proti 5' koncu) od mesta 0, kar je raziskovalce napeljalo na misel, da to zaporedje igra ključno vlogo pri uravnavanju ekspresije gena. Posledično je najbolj preučena ravno LCR β-globinskega lokusa.

Tega sestavlja 5 mest, hipersenzitivnih za vezavo DNaze 1, označenih 5'HS1-5 (HS-hypersensitive site), ki so tkivno specifična. Od tega se 5'HS1-3 obnašajo kot navadni ojačevalci, 5'HS5 kot izolator, funkcija 5'HS1 pa je še nedoločena. Ta mesta interagirajo s promotorji lokusa in prav ta interakcija zagotavlja tkivno specifičnost delovanja LCR, torej zagotavlja, da LCR β-globinskega gena vpliva le na ta lokus in ne na katerega koli drugega.

Ključni del te ojačevalne aktivnosti je ohranjeno zaporedje na 5'HS2, dolgo pri. 200kbp. To predstavlja vezavno mesto za Maf transkripcijske faktorje in prek te povezave naj bi LCR vplivala na vezavo RNA polimeraze II na promotorsko regijo, mehanizem tega pa je še neznan. LCR imajo še eno pomembno lastnost, in prav ta jih loči od navadnih ojačevalcev (enhancerjev). To je modificiranje strukture kromatina prek acetilacije histonov in metilacije DNA, kar prav tako pomembno vpliva na gensko ekspresijo.

Za mehanizem delovanja LCR obstaja več modelov, za splošno sprejetega velja model zanke. Ta se tvori na delu kromatina med LCR in lokusom, ter ju tako približna na razdaljo, kjer lahko transkripcijski faktorji, vezani na HS LCR, delujejo na promotorsko regijo gena. Naenkrat lahko vpliva samo na en promotor, zato prihaja v fazi razvoja do t.i. "flip-flopa" med različnimi promotorji, kar dokazujejo različne stopnje izražanje genov istega lokusa v različnih fazah embrionalnega razvoja.

Ekspresija genov lokusa β-globina

Model genske ekspresije, ki vključuje LCR, je najbolj raziskan na modelu beta-globinskega lokusa. Ljudje imamo gen za β-globin na p kraku kromosoma 11, medtem ko se gen za α-globin nahaja na p kraku kromosoma 16. Obe podenoti se združujeta v tetramer in tako tvorita globinski del hemoglobina. Pri miših je gen za β-globin na kromosomu 7. Pri ljudeh in miših je zgradba lokusa podobna, a je pri ljudeh sestavljen iz petih genov, pri miših pa iz štirih. Vsi geni so regulirani z eno regulatorno regijo lokusa (LCR).Naenkrat je lahko z LCR reguliran le en gen, zato geni med sabo tekmujejo. V razvoju organizma se izražajo različni geni. Tako se pri miših gen εy in βH1 izražata v embrionalni fazi, βmajor in βminor pa pri odraslih miših. Pri človeku se geni izražajo v treh fazah - ε v obdobju embria, Gγ in Aγ v obdobju fetusa, δ in β pa v odrasli dobi.

Rdeče krvničke so dokaj kratkožive (4 mesece), zato jih mora telo producirati v velikem številu (več kot 2 mio/dan), da lahko zadosti potrebam po kisiku. Zato so geni za β-globin izražani v velikem merilu.Ta stopnja izražanja je dosežena z zelo močnim ojačevalnim zaporedjem navzgor od samega lokusa. To regijo so prvič odkrili pri pacientih z β talasemijo, ki so imeli vse gene na lokusu nedotaknjene, a je bilo mesto LCR izrezano. Še vedno potekajo raziskave glede virusne transdukcije, s katero bi pacientu vcepili LCR.

Pri zdravih osebkih, se med LCR in genom tvori zanka, zaradi česar se LCR, kljub temu, da je sicer pri β-globinu oddaljen 40 - 60 kBp, približa genu na mnogo krajšo medsebojno razdaljo. Zaradi zanke se del zaporedja izviha in je tako inaktivirano. Pomembno vlogo pri tvorjenju zank igrajo aktivatorji, ki se lahko vežejo na promotorje samih genov, ali pa na HS dele LCR(DNase I hypersensitive sites - mesta na kromatinu, ki so občutljivejša na cepitev z DNazo I). Pri β-globinu so takšnii aktivatorji trije: EKLF - cinkov prst, GATA-1 in NF-E2. Represor, ki vpliva na transkripcijo, je CTCF, ki se lahko veže med aktivator in promotorsko regijo. Vzpostavitev HS v LCR je pomembna za tvorbo zanke, ki se sicer ne vzpostavi. To posledično pomeni, da LCR in gen ne prideta na dovolj kratko medsebojno razdaljo, zaradi česar transkripcija ne poteče.

Povzetek

Za uravnavanje genske ekspresije so zelo pomembne 3D strukture v kromatinu, predvsem razni cis elementi navzgor od mesta transkripcije. Poudarek se daje lokusnim kontrolnim regijam (LCR), ki skupaj z lokusom in vmesnimi elementi (npr. zanko) sestavljajo kromosomske domene. LCR predstavljajo vezavno mesto za različne transkripcijske faktorje, sestavlja pa jih več visoko specifičnih mest. Ta skrbijo za specifičnost vezave s promotorji na lokusu in tvorbo zanke, ki približa LCR sami regulatorni regiji. To delovanje je najbolj pojasnjeno na primeru β-globinskega gena, po katerem tudi povzemamo naš seminar.

Viri

1. Li, Q., Peterson, K.R., Fang, X. in Stamatoyannopoulos, G. Locus Control Regions Blood. 1.11.2002; 100(9): str. 3077–3086

2. Elefant, F., Su, Y., Liebhaber, S.A. in Cooke, N.A. Patterns of histone acetylation suggest dual pathways for gene activation by a bifunctional locus control region EMBO J., 15.12.2000; 19(24): str. 6814–6822

3. Gibcus, J. H. & Dekker, J. The hierarchy of the 3D genome. Mol. Cell 49, 773–82 (2013)

4. Kim, A. & Dean, A. Chromatin loop formation in the β-globin locus and its role in globin gene transcription. Mol. Cells 34, 1–5 (2012)

5. Palstra, R.-J. T. S. Close encounters of the 3C kind: long-range chromatin interactions and transcriptional regulation. Brief. Funct. Genomic. Proteomic. 8, 297–309 (2009).