Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme

Uvod

Bakteriofagi se morajo za uspešen vdor v bakterijo v prvi stopnji adsorbirati na celično membrano s pomočjo receptorjev in nato injicirati lasten dedni material v tarčno celico. Če sta prva dva koraka uspešna, jih čaka v celici še ena prepreka: restrikcijsko-modifikacijski (R-M) sistemi. Te vzpostavljajo bakterije in temeljijo na prepoznavi določenih zaporedij v lastni in tuji DNA. R-M sistemi fagno DNA razrežejo, bakterijsko pa modificirajo z metiltransferazami (MTazami) in jo s tem obvarujejo pred delovanjem restriktaz. Da bi se fagi zaščitili pred bakterijskimi R-M sistemi, so razvili različne antirestrikcijske mehanizme. Mednje spadajo različne modifikacije nukleotidov, izguba prepoznavnih mest in proteini, ki vplivajo na aktivnost R-M sistemov.

Metilacija DNA

Ločevanje R-M sistemov med fagno in bakterijsko DNA ni popolno: MTaze lahko preoblikujejo celotno fagno DNA, preden delujejo nanjo restriktaze, zato je bakterija ne prepozna kot tujek. Verjetnost tega je 10^-6 do 10^-2 (številke se razlikujejo med posameznimi študijami, nekateri navajajo od 10^-8 do 10^-1), odvisno od posameznih R-M sistemov. Fagni delci, ki nastanejo s pomnoževanjem te DNA, nosijo enak modifikacijski vzorec in so pri okužbi bakterij z enakim R-M sistemom uspešni. Če pa ima tarčna bakterija drugačen R-M sistem od prve in MTaze ne modificirajo fagne DNA na novo, so fagi prepoznani na drugih mestih in poteče restrikcija. Nekateri fagi nosijo v svojem genomu zapis za metilaze. Takšni so fagi B. subtilisa: ø3T, p11B, SPβ in SPR. Ti encimi so velikokrat multispecifični, saj prepoznajo več zaporedij DNA.

Zmanjšanje števila prepoznavnih mest

Ena od prilagoditev fagov na R-M sisteme je tudi zmanjšanje števila prepoznavnih in restrikcijskih mest. Manjše kot je število teh, manjša je verjetnost za restrikcijo, hitrejša je popolna metilacija fagne DNA in fag se izogne težavam pri izražanju genov zaradi metilacije. Zmanjšanje števila prepoznavnih mest je značilna za fage z dsDNA in ssDNA, predvsem tiste, katerih gostitelji imajo R-M sistem tipa II. V nedavnih študijah so primerjali število prepoznavnih mest v genomih fagov s statističnimi pričakovanji glede na gostiteljski R-M sistem. Če je bil količnik med tema parametroma večji ali enak 1, so raziskovalci sklepali, da selekcijski pritisk verjetno ni prisoten. Če je nižji od 1 oziroma 0,8 (v raziskavi so to vrednost postavili kot prag), je to lahko indikacija selekcije prepoznavnih mest. Razlog za prevlado tega antirestrikcijskega mehanizma pri R-M sistemu tipa II lahko razložimo s počasnim prilagajanjem sistema na mutacije prepoznavnih mest faga, saj sta restriktaza in MTaza ločena proteina. Da R-M sistem spremeni prepoznavno zaporedje, morata prepoznavni domeni obeh proteinov spremeniti specifičnost. R-M sistem II se prilagaja prepočasi, v tem času pa se lahko zmanjša število prepoznavnih mest v genomu faga. Nasprotno imajo drugi tipi R-M sistemov skupno prepoznavno domeno za restriktazo in MTazo, zato so bolj prilagodljivi pri koevoluciji s fagi. Prav tako so R-M sistemi II veliko bolj raznoliki, zato univerzalni antirestrikcijski sistem ne pride v poštev, medtem ko so pri R-M I primer tega protein ocr in SAM-hidrolaze.

Bakteriofag λ

Ena od prilagoditev fagov λ na EcoKI (R-M kompleks tipa I) E. coli K-12, ki zelo neučinkovito modificira nemetilirano DNA, je izražanje proteina ral (angl. restriction alleviation), velikega 7,6 kDa, v zgodnji fazi okužbe. EcoKI je sestavljen iz podenot R (restriction), M (modification) in S (specificity). Aktiven je v dveh oblikah: M.EcoKI (M₂S₁), ki ima samo metiltransferazno aktivnost, in R.EcoKI (R₂M₂S₁), ki je bifunkcionalna restrikcijska endonukleaza ter metiltransferaza. Ral nanj deluje tako, da spremeni njegovo encimsko dejavnost – močno zmanjša njegovo restrikcijsko in usmeri metilacijsko aktivnost iz vzdrževalne, ki preferira metilacijo hemimetilirane DNA, proti de novo metilaciji. Nemodificirana DNA faga λ je razrezana enako učinkovito kot DNA faga λ brez gena ral, saj ral ni pravočasno sintetiziran. Vendar bodo tisti fagi λ, ki se restrikciji izognejo, v celoti metilirani veliko hitreje od fagov brez ral. O ral ni znano veliko, prav tako še ni bila razvozlana njegova struktura. Ena od hipotez delovanja je vezava ral z M₂S₁ kompleksom ali z eno izmed njegovih podenot, kar poveča afiniteto M₂S₁ do nemodificirane DNA. S tem antagonizira podenoto R, saj se ne more vezati na M₂S₁. Druga hipoteza pa je, da ral izpodrine podenoto R v R₂M₂S₁ in EcoKI na ta način onemogoči restrikcijsko aktivnost.

Bakteriofag T4

Pri paru T4 bakteriofaga in E. coli lahko opazujemo verigo evolucijsko uspešnih mutacij (govorimo o koevoluciji), s katerimi poskušata vzajemno prelisičiti mehanizme nasprotnika, ki pomenijo njuno uničenje. Prva prilagoditev je ta, da so T4 bakteriofagi zamenjali citozin v svoji DNA s hidroksimetilcitozinom (HMC). Ker R-M sistemi prepoznajo specifična zaporedja DNA, ki vsebujejo citozin, so DNA s HMC nanje odporne. V odgovor na bakteriofagno prilagoditev nukleotidnega zaporedja so nekatere bakterije modificirale R-M sisteme – MDS (angl. modification-dependent R-M systems) so specifični za metilirano ali hidroksimetilirano DNA. Bakteriofag T4 lahko obide tudi modificirane bakterijske restrikcijske sisteme tako, da HMC ostanke v DNA glukozilira (glikozilira z glukozo). V takem primeru je glukoziliranih 100 % HMC ostankov. Od tega je 70 % povezanih z α-vezmi, 30 % pa z β-vezmi.

Ker se je E. coli na glukozilirano bakteriofagno DNA prilagodila z dvokomponentnimi sistemi, so T4 bakteriofagi naredili še korak naprej v evoluciji in lahko poleg DNA med okužbo v bakterijsko celico injicirajo tudi protein IPI (angl. internal protein I), ki onemogoči dvokomponentni R-M mehanizem. Dvokomponentni bakterijski MD sistem sestavljata GmrS (angl. glucose-modified restriction S) proteinska komponenta (velika 36 kDa) in GmrD protein (27 kDa), ki je zapisan na profagu – delu fagne DNA, ki je vgrajen v bakterijsko DNA. GmrS in GmrD sta ločeno neaktivna in šele skupaj lahko razgradita različne tipe glukoziliranih hidroksimetiliranih DNA (iz sevov bakteriofagov T4, T2 in T6). Cel encim GMR lahko razgradi tako α-glukozil-HMC T4 DNA in β-glukozil-HMC T4 DNA, ne razgradi pa nemodificirane DNA, kar seveda vključuje celici lastno, torej bakterijsko DNA, ampak tudi DNA faga T4, kjer citozin ni zamenjan s HMC ali kjer HMC ni glukoziliran. Zrel protein IPI* inaktivira restriktazno aktivnost takega sistema. Pokazana je bila močna asociacija med IPI* in GmrS in GmrD. Kot vezavno mesto za GmrSD je bil predlagan izpostavljen hidrofoben vozel. V virusni kapsidi je okoli 360 molekul zrelega proteina IPI*. IPI se sintetizira z N-končno sekvenco za prepoznavanje kapside (angl. capsid targeting sequence, CTS), ki protein usmeri v prokapsidno ogrodje, nato pa jo proteaza gp21, ki sodeluje pri sestavljanju glave faga, odcepi. Zrel protein, dolg 76 aminokislinskih ostankov, se lahko skupaj z DNA injicira v gostiteljsko bakterijsko celico. IPI* se lahko iz fagnega delca v bakterijsko celico prenese skozi ozki (30 Å) odprtini na vrhu ali na dnu repa zaradi svoje kompaktne strukture (dve majhni β-ploskvi, ki sta na N- in C-koncih zaščiteni z α-vijačnicama).

Poleg IPI lahko T4 fagi svojo DNA pred izključitvenimi mehanizmi gostiteljske celice zaščitijo tudi z drugimi proteini, kot je na primer protein g2, ki DNA ščiti pred eksonukleazo V (kompleks RecBCD v E. coli), ki razgradi le linearno dsDNA in linearno ssDNA. Tudi drugi bakteriofagi družine Myoviridae, v katero spadajo T4 fagi, na lokusu ip1 nosijo zapis za proteine, ki verjetno ščitijo DNA fagov poddružine Tevenvirinae pred dvokomponentnimi GmrSD encimskimi sistemi. Proteini so med seboj sorodni, zapisani pa so lahko kot en gen ali kot gruča genov med odprtim bralnim okvirjem (angl. open reading frame, ORF) 47.B in ORF 2. Proteinski produkt gena ip1 v fagu T4 imenujemo IPI, produkte genov podobnih ip1 v drugih fagih pa imenujemo od IP5 do IP9, čeprav so geni za proteine od IP2 do IP4 zapisani na od lokusa ip1 oddaljenem mestu na kromosomu.

V uropatogenem sevu E. coli je bil pokazan encim, podoben GmrSD, ki je le iz ene polipeptidne verige, zato je imun na delovanje IPI*. Poskusi so pokazali, da lahko nekateri T4 fagi okužijo tudi tako prilagojene bakterije, vendar mehanizem infekcije ni znan.

Bakteriofag T7

Bakteriofag T7 je razvil svojevrsten način kljubovanju R-M sistemom E. coli, in sicer s proteinom ocr (angl. overcome classical restriction). Za tega zapisuje gen 0.3, ki je eden prvih izraženih genov ob okužbi bakterijske celice z bakteriofagom. T7 takoj po vdoru skozi bakterijsko membrano ne vnese celotnega genoma, temveč zgolj 20 %, ki jih prepiše gostiteljska RNA-polimeraza. V tem delu genoma sta med drugimi gena 1 in 0.3. Prvi zapisuje za fagno RNA-polimerazo, ki je potrebna za prepis preostanka genoma T7, drugi pa omogoča transkripcijo ocr-mRNA. Ta del genoma tudi nima prepoznavnega zaporedja za restriktazo EcoKI. Tako nastali ocr se veže na R-M sisteme tipa I in jih s tem inaktivira. Proti R-M tipa II je neučinkovit. Celoten T7 genom se začne prepisovati le, ko je koncentracija ocr dovolj velika, da je zaščiten pred restrikcijo.

Struktura ocr

Struktura ocr je bila določena z rentgensko kristalografijo. Ocr je homodimer velikosti 26 kDa. Njegovi podenoti sta sestavljeni iz štirih α-vijačnic, v dimer ju povezujeta kratki α-vijačnici C. Za njegovo strukturo je značilno, da po obliki in porazdelitvi naboja posnema strukturo B-DNA , kar mu omogoča kompetitivno vezavo na restriktaze tipa I. Negativno nabiti aminokislinski ostanki Asp in Glu so tu obrnjeni navzven, njihovi položaji pa so analogni položajem fosfatnih skupin pri B-DNA. Ti ostanki so v delno ohranjenih motivih na α-vijačnicah obeh podenot. Monomerni enoti sta zamaknjeni pod kotom 34° ena na drugo – podobno kot pri DNA, ki se v katalitičnem mestu restriktaz I upogne na podoben način. Dolžina dimera je enakovredna približno 24 bp B-DNA.

Interakcija z restriktazo

Večkrat proučevan je bil tudi mehanizem interakcije ocr z različnimi restriktazami tipa I, poglavitno EcoKI. V primeru M.EcoKI se ocr veže z 1:1 stehiometrijo, torej en dimer na vsako M.EcoKI. Ker je struktura dimera rahlo večja od B-DNA, se M.EcoKI ne more popolnoma »oviti« okoli njega, kot se lahko pri DNA. Vezava ocr ima negativno ΔG (ki je nižja od ΔG vezave DNA na isti encim), kot tudi močno negativno ΔH (sprememba entropije pa je manj ugodna). Vzrok so najverjetneje elektrostatske interakcije med stranskimi skupinami Asp in Glu ocr in encimom. ΔG za protein je toliko nižja, ker je njegova struktura za razliko od B-DNA že pod ustreznim kotom za vezavo (ob interakciji z DNA mora M.EcoKI najprej porabiti energijo, da molekulo upogne in s tem olajša njeno vezavo). Raziskava je pokazala tudi sposobnost vezave na M₁S₁ (kamor se veže en dimer) in na podenoto R (dva dimera). Posledično ima R.EcoKI pet možnih vezavnih mest za ocr, ki pa se med seboj delno prekrivajo. Ocr poleg EcoKI uspešno inhibira člane vseh štirih družin R-M sistemov tipa I. To pokaže, da se ne veže zgolj na za tarčno zaporedje specifično podenoto S, ampak tudi inhibira podenote R aktivne restriktaze I, ki se nespecifično vežejo na DNA ob pomanjkanju kofaktorjev.

Bakteriofag T3

Bakteriofag T3 se restrikciji izogne na skoraj enak način, od mehanizma vnosa DNA do izražanja ocr-podobnega proteina. Ta ima poleg drugih lastnosti ocr tudi sposobnost hidrolize S-adenozil-L-metionina (je SAM-hidrolaza), ki je pomemben kofaktor za delovanje restriktaz. Sicer je eksperimentalno delo pokazalo, da hidrolazna aktivnost tega proteina ni ključna za preprečitev restrikcije. Ta protein inaktivira R-M sisteme tipa I in III, na R-M II pa ne učinkuje.

Viri in literatura

• Labrie, S. J., Samson, J. E., Moineau, S. Bacteriophage resistance mechanisms. Nature Reviews Microbiology, 2010, 8(5), str. 317–327
• Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI*. J. Mol. Biol., 2007, 366, str. 779–789
• Rusinov, I. S. et al. Avoidance of recognition sites of restriction-modification systems is a widespread but not universal anti-restriction strategy of prokaryotic viruses. BMC Genomics, 2018, 19(1), str. 885
• Walkinshaw, M. D. et al. Structure of Ocr from bacteriophage T7, a protein that mimics B-form DNA. Mol. Cell, 2002, 9, str. 187–194
• Atanasiu, C., Su, T. J., Sturrock, S. S., Dryden, D. T. Interaction of the ocr gene 0.3 protein of bacteriophage T7 with EcoKI restriction/ modification enzyme. Nucleic Acids Res., 2002, 30, str. 3936–3944