R-zanke in G-kvadrupleksi pri organizaciji genoma in transkripciji

Uvod

Kromatin si navadno predstavljamo kot dvojno DNA vijačnico, ovito okoli histonskih proteinov, vendar je njegova oblika v celici dejansko vselej spreminjajoča in jo lahko opazujemo v različnih konformacijah. Ena izmed teh je tri vijačna struktura, imenovana R-zanka, ki nastane, ko se veriga RNA vrine v DNA vijačnico in poveže z eno izmed verig. Ta struktura najpogosteje nastane med transkripcijo, ko se novo sintetizirana mRNA veže nazaj na svojo matrično DNA verigo, lahko pa se tvori tudi ob vezavi dolgih ne kodirajočih RNA (angl. lncRNA) na specifične regije genoma. Nagnjenost kromatina k tvorbi R-zank je odvisna od mnogih dejavnikov, recimo dodatnega zvitja, ključen pomen pa ima samo zaporedje nukleotidov. Najugodnejše so regije, kjer je matrična DNA veriga bogata z citozinom, saj je povezava z gvaninom bogato RNA verigo zelo termodinamsko ugodna, prav tako pa se v izpodrinjeni DNA verigi tripleti gvaninskih baz lahko organizirajo v sekundarno strukturo, imenovano G-kvadrupleks (G4). To je stabilna struktura, v kateri se štirje gvanini povežejo v ravninske G-tetrade z vodikovimi vezmi, te pa se zlagajo ena nad drugo in jih stabilizirajo kovinski ioni (npr. K⁺), prav tako pripomorejo k skupni obstojnosti kompleksa R-zanke. Oba pojava imata v genomu pomembno vlogo pri regulaciji transkripcije, epigenetskih procesih in popravljalnih mehanizmih DNA [1].

Neposredna in posredna regulacija R-zank

Poznamo dvoje oblik regulacije nastanka/razgradnje R-zank: neposredno in posredno. Pri neposredni regulaciji se protein veže na R-zanko in jo stabilizira ali pa povzroči njeno razgradnjo, pri posredni pa pride do vpliva na strukturo kromatina, dodatno zvitje, transkripcijo. Eden od glavnih posrednih mehanizmov so transkripcijsko-replikacijski konflikti, saj je na tem mestu DNA v enoverižni obliki, prisotna je pre-mRNA, hkrati pa se zaradi počasnejšega premikanja RNA-polimeraze II (RNAPII) zaradi steričnega oviranja upočasni transkripcija.

Ker prekomerno število R-zank povezujemo z mnogimi patološkimi stanji kot so rak in različne nevrodegenerativne bolezni, celice potrebujejo posebne mehanizme, ki R-zanke odstranjujejo. Poznamo jih več vrst, in sicer jih večina deluje na podlagi encimov. Ena skupina med njimi so endonukleaze, ki cepijo fosfodiestrske vezi v molekuli mRNA in s tem razgrajujejo RNA v R-zanki. Primera teh encimov sta RNAzaH1 in RNAzaH2. R-zanke pa lahko odstranjujejo tudi helikaze, ki pomagajo pri razvijanju hibrida nukleinskih kislin s cepitvami vodikovih vezi ob porabi energije ATP – večinoma lahko delujejo bodisi na hibrid DNA:RNA bodisi na G-kvadruplekse. Obstajajo še drugi mehanizmi razgradnje R-zank, ki pa še niso popolnoma pojasnjeni [1,2,3].

R-zanke v povezavi z regulacijo transkripcije

R-zanke najpogosteje nastanejo na promotorskih in terminatorskih regijah genov. Pojavnost R-zank na promotorskih regijah je večinoma povezana s promocijo transkripcije zaradi vezave transkripcijskih faktorjev na G-kvadruplekse. Na terminatorskih regijah omenjene zanke nastajajo kot matrica za vezavo helikaze SETX, ki zanko razdre, nato pa se na RNA veže eksonukleaza XRN2, ki jo razgradi in omogoči odstranitev RNAPII s čimer se transkripcija zaključi.

Ker je usoda RNA molekule v R-zanki njena relativno hitra razgradnja, je ta primernejša tarča za celične mehanizme, ki spreminjajo stabilnost in uravnavajo regulacijo R-zank brez vplivov na genom. Najpogostejša modifikacija RNA je pretvorba A v I (inozin) – to reakcijo katalizira skupina encimov RNA-specifične adenozin deaminaze. Ti nadzirajo količino telomernih R-zank v rakavih celicah in sicer tako, da to alternativno parjenje baz omogoči prepoznavo in razgradnjo zank z RNAzoH2. Druga oblika RNA modifikacije je metilacija adenozinov na N6 atomu (m6A), kar stabilizira strukture R-zank; obratno torej izguba teh modifikacij povzroči drastično znižanje njihovega števila in napake pri zaključevanju transkripcije [1,4].

Vplivi na epigenetske modifikacije

R-zanke vplivajo tudi na epigenetske modifikacije v celici. Tako lahko na genski zapis vplivajo tudi dolgoročno, ne samo ob svojem nastanku.

V splošnem velja, da metilacija histonov zavira, acetilacija pa promovira transkripcijo. Dokazali so, da odsotnost kompleksa, ki tri-metilira Lys27 na H3 podenoti histona in hkrati prisotnost histon-acetiltransferaznega kompleksa v mišjih matičnih celicah povzroči tvorbo promotorskih R-zank. Nasprotno obratna situacija – razgradnja R-zank z RNAzoH zaradi mutacije, ki poveča njeno izražanje - povzroči povečanje obsega transkripcije prvega in zniža izražanje drugega omenjenega kompleksa.

R-zanke se tvorijo na nemetiliranih CpG otočkih promotorja, R-zanke pa z G-kvadrupleksi hkrati pomagajo ohranjati to ne-metilirano stanje, saj se nanje veže DNA metiltransferaza 1. To ima za posledico ujetje tega encima v katalitično neaktivni obliki na mestih, ki so hipometilirana. Na ta način torej R-zanke pasivno blokirajo metilacijo DNA. Poznani so tudi že mehanizmi, ko celica ob zaustavitvi rasti ali ob poškodbi DNA začne izražati protein GADD45A. Nanj se nato lahko veže protein TET1, ki aktivno demetilira CpG otočke [1].

Vloga v organizaciji genoma

V jedru je struktura kromatina organizirana na več ravneh, ki jih okvirno delimo na kompartmente, topološko asociirane domene (TAD) in kromatinske zanke. Tridimenzionalna ureditev genoma omogoča ustrezne stike med genomskimi elementi, prav tako pa vzpostavlja jasne meje med sosednjimi regijami. Ključno vlogo pri uravnavanju razdalj med posameznimi genomskimi elementi imajo kromatinske zanke znotraj TAD, ki nastanejo z drsenjem DNA verige skozi obroč kohezina. Proces se ustavi, ko kohezin naleti na vezan stop signal, najpogosteje arhitekturni protein CTCF, ki deluje kot mejni element in določa robove kromatinskih zank (slika 1: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12044674/figure/F4/) [1,5].

Regulacija vezave CTCF in vplivi

Prav na mejah med TAD ter na mestih vezave CTCF se pogosto pojavljajo tudi R-zanke in G4 kompleksi, torej ni presenetljivo, da pri urejanju genoma igrajo določeno vlogo. CTCF se veže na specifična DNA zaporedja, vendar je stabilnost vezave odvisna od mnogih faktorjev, kot so recimo lokalne strukture. Eksperimentalni podatki kažejo, da prisotnost R-zank v bližini CTCF motiva poveča njegovo afiniteto za vezavo, dodatna prisotnost G4 struktur pa vezavo še okrepi. Ključno je, da se CTCF torej ne veže direktno na te strukture, ampak da delujejo posredno, tako da povečajo dostopnost DNA ter stabilizirajo konformacijo, ki je ugodna za vezavo. Regije, ki so bogate z R-zankami in G4, so zato pogosteje povezane z vezavo CTCF, kar prispeva k vzpostavitvi jasno definiranih območij z omejenimi medsebojnimi interakcijami. V širšem kontekstu lahko R-zanke in G4 vplivajo na delovanje kohezinskega kompleksa tudi neodvisno od CTCF. Določene raziskave kažejo, da lahko te strukture delujejo kot funkcionalna ovira oz. stop signal, neodvisno od drugih proteinov. S tem dodatno prispevajo k nastanku in regulaciji kromatinskih zank [5].

Vpliv na ureditev kohezina

Kohezin se na DNA, ko je ta v odprti konformaciji, naloži v obroč, skozi katerega nato DNA drsi in s tem omogoča nastanek kromatinske zanke. Proces nalaganja in zapiranja obroča se odvija ob pomoči nalagalnega kompleksa NIPBL-MAU2, ki katalizira vezavo kohezinskega kompleksa. Študije kažejo, da se lahko ena izmed podenot kohezinskega kompleksa v določenih kontekstih neodvisno veže na R-zanko, ter po uspešni vezavi promovira sestavitev funkcionalnega kompleksa, tudi v odsotnosti NIPBL-MAU2. Takšni mehanizmi lahko delujejo kot dodatna ali alternativna pot usmerjanja kohezinov na specifična mesta genoma, zlasti v območjih aktivne transkripcije, kjer so R-zanke pogoste [1].

Zaključek

R-zanke so kot skupek DNA in RNA hibrida ter G-kvadrupleksa torej strukturna oblika kromatina, ki imajo pomembno vplivajo na izražanje genov, epigenetske modifikacije kromatina in organizacijo genoma. Njihova pojavnost je rezultat skupka natančno reguliranih in medsebojno povezanih procesov, ki bodisi vodijo v nastanek bodisi v razgradnjo R-zank. Te so eden ključnih dejavnikov pri elongaciji in terminaciji transkripcije, posredno pa nanjo vplivajo tudi preko regulacije metilacij DNA in kovalentnih histonskih modifikacij. Poleg tega imajo pomembno vlogo pri tridimenzionalni organizaciji genoma, kjer vplivajo na vezavo proteinov in na delovanje kohezinskega kompleksa. Navkljub dosedanjim odkritjem pa to ostaja področje, na katerem je še ogromno neznanega [1].

Viri

[1] P. Wulfridge, K. Sarma: Intertwining roles of R-loops and G-quadruplexes in DNA repair, transcription, and genome organization. Nat. Cell Biol. 2024, 26, 1025–1036. DOI: 10.1038/s41556-024-01437-4
[2] L. Goehring, T. T. Huang, D. J. Smith: Transcription-replication conflicts as a source of genome instability. Annu. Rev. Genet. 2023, 57, 157–179. DOI: 10.1146/annurev-genet-080320-031523
[3] M. Hyjek, M. Figiel, M. Nowotny: RNases H: Structure and mechanism. DNA Repair 2019, 84, 102672. DOI: 10.1016/j.dnarep.2019.102672
[4] A. L. Yablonovitch, P. Deng, D. Jacobson, J. B. Li: The evolution and adaptation of A-to-I RNA editing. PLoS Genet. 2017, 13, e1007064. DOI: 10.1371/journal.pgen.1007064
[5] P. Wulfridge, Q. Yan, N. Rell, J. Doherty, S. Jacobson, S. Offley, S. Deliard, K. Feng, J. E. Phillips-Cremins, A. Gardini idr.: G-quadruplexes associated with R-loops promote CTCF binding. Mol. Cell 2023, 83, 3064-3079.e5. DOI: 10.1016/j.molcel.2023.07.009