Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda

Bakteriofag lambda je virus, ki okuži E. coli. Okužba z virusom se lahko začne razvijati v dve smeri, razvije se lahko litični ali lizogeni cikel. Odločitev kateri cikel se bo razvil, je odvisna od mnogih dejavnikov kot so temperatura, velikost celice, št. fagov, ki okuži posamezno celico … Čeprav je že veliko znano o genih, ki so ključni pri odločitvi med cikloma, pa še vedno obstaja veliko neznank pri samem poteku odločanja. Prav tako se moramo zavedati, da posamezno celico ponavadi okuži več virusov hkrati, vendar ne vsi ob istem času. Tako je pomembno kakšno kapaciteto transkripcije ima posamezna celica, torej koliko RNA polimeraze in DnaA replikatorskega iniciatorskega proteina je na voljo, ter kje v celici se nahajajo ti proteini glede na položaj virusne DNA v celici. V sestavku je najprej pojasnjen mehanizem odločanja z izražanjem in regulacijo genov, nato vpliv na odločitev z upoštevanjem prisotnosti več različnih fagov, na koncu pa še časovni potek okužbe in sprememba odločitve.

Regulacija genov

Takoj ob vstopu virusne DNA v citoplazmo se začne transkripcija genov, ki so ključni za odločitev med litičnim in lizogenim ciklom. Ti se nahajajo na operonih, ki so pod kontrolo promotorjev pR in pL. Na operonu s promotorjem pL se nahajajo geni za N in CIII, na operonu s promotorjem pR pa geni za Cro, CII, O, P in Q.

Ključni geni vključeni v odločitev

Protein N je transkripcijski antiterminator in omogoči, da se iz pL in pR transkriptov prepišejo ostali zgodnji geni. Na pL in pR se nahaja več terminatorskih mest in ko N ni prisoten na teh pride do terminacije. Ko pa je prisotnega dovolj N, se veže na nut (N utilization site)in omogoča nastanek daljših transkriptov.

Cro se veže na operator oR in po negativni povratni zanki nadzira delovanje promotorja pR.

CII je pomemben za odločitev in spodbuja lizogeni cikel ter spodbudi izražanje CI, ki je lizogeni efektor. CI se izraža iz promotorjev pRE in pRM. CIII je pozitivni regulator lizogenega cikla. Deluje kot inhibitor CII inhibitorja.

Q je 'vratar' litičnega cikla. Če doseže pražno vrednost se začne transkripcija poznih genov in litični cikel. Q deluje kot antiterminator poznih genov.

O in P sta ključna za iniciacijo replikacije fagne DNA.

Vplivi na odločitev

Okolje v katerem se celica nahaja fluktuira, kar se odrazi v različnih celičnih odzivih. To fagi izkoriščajo za povečanje fenotipske diverzitete. Zaradi fluktuacije v okolju pride do fluktuacij v sintezi proteinov, kar vpliva na odločitev med litičnim in lizogenim ciklom. Poleg tega pa je ključen proces za vzpostavitev katerega koli od ciklov replikacija DNA. Če v fagih ni prisoten gen za P, ti ne morejo niti lizirati celic, niti ne poteče lizogeni cikel. Torej ena sama kopija virusne DNA ni dovolj, da bi se vzpostavil kateri koli od ciklov. Za odločitev je pomembna tudi hitrost replikacije. Z njo se poveča število fagnih DNA v celici, kar spremeni hitrost transkripcije in s tem translacije.

Potek odločitve

Prva faza je pri obeh ciklih enaka. Najprej poteče transkripcija N in Cro. Sledi izražanje CIII, CII, O, P in Q. Prehitro odločitev za enega od ciklov prepreči Cro (preko zgoraj omenjene negativne povratne zanke). Sledi faza odločitve na katero vpliva tekmovanje med CII in Q. Za vzpostavitev lizogenega cikla se mora nakopičiti CII, ki spodbudi sintezo CI, ki pa ohranja odločitev na strani lizogenega cikla. CI in Cro tekmujeta za vezavna mesta na operatorjih oL in oR in s tem regulirata izražanje drug drugega. CI zavre sintezo Cro in replikacijo DNA. Fluktuacija hitrosti replikacije DNA vpliva, hitrost izražanja CI. Njegovo izražanje pa se regulira tudi preko pozitivne povratne zanke. Če je aktivnost CII nizka in se poveča izražanje Q se bo razvil litični cikel. Pri tem bo Cro zaustavil sintezo CI in dodatno prispeval k izbrani odločitvi.

Glasovanje fagov za odločitev med litičnim in lizogenim ciklom

Do nedavnega je prevladovalo mišljenje, da je odločitev med litičnim in lizogenim ciklom izvedena na ravni celice. To bi pomenilo, da bi vsi fagi, ki so okužili neko celico vstopili v enak cikel. Lizogeni cikel naj bi prevladal v neugodnem okolju za razmnoževanje fagov (npr. celično stradanje). Tako je namreč omogočena shramba njegove DNA vse dokler niso pogoji za njegov razvoj optimalni. Pri pogojih, ki so ugodni za razmnoževanje fagov, pa naj bi prevladal litični cikel. Novejše raziskave so s pomočjo razvoja tehnologije, ki je omogočil spremljanje procesov pri boljši resoluciji, pokazale, da se fagi, ki okužujejo celico, vsak zase odločijo za litični ali lizogeni cikel. Odločitev med tema dvema cikloma je torej individualna za fag.

Skladno s to ugotovitvijo lahko govorimo o obstoju treh možnih izidov po okužbi bakterijske celice. Poteče lahko lizogeni cikel, litični cikel ali pa hkrati potečeta oba cikla. Lizogeni cikel poteče, ko se vsi fagi, ki okužijo celico, odločijo za ta cikel. Enako velja za litični cikel. Če se zgodi, da odločitve med cikli posameznih fagov niso skladne pa poteče tisti ki prevlada. Običajno je to litični cikel, a vseeno ne smemo izključiti možnosti poteka lizogenega cikla. Pri nekaterih izmed celic, pri katerih prevlada litični cikel je mogoče opaziti tudi integracijo nekaterih fagnih DNA v genom gostiteljske celice. V tem primeru potečeta oba cikla.

Potek obeh ciklov

Potek obeh ciklov je posledica tako imenovane zmedenosti fagov, kar lahko obrazložimo s pomočjo regulacije njihovih genov. Raziskovalci predvidevajo, da je zmedenost fagov posledica prisotnosti določene količine proteina CII med potekom litičnega cikla. Aktivnost CII namreč povzroči izražanje integraze, ki je ključna za vključevanje fagne DNA v genom gostiteljske celice.

Integracija fagne DNA je zelo reguliran proces, odvisen tako od integraze kot tudi ekscizionaze (Xis), ki inhibira integracijo fagne DNA. Zgodaj po virusni okužbi celice se pod nadzorom promotorja pL izražata gen za integrazo in gen za ekscizionazo, a je zaradi retroregulacije gena za integrazo količina nastale integraze manjša od količine ekscizionaze. Zato ni verjetno, da bi se integracija DNA zgodila zgodaj po infekciji bakterije. Kasneje v celicah, kjer poteka lizogeni cikel, protein CI povzroči utišanje izražanja genov za integrazo in ekscizionazo, ki sta pod nadzorom promotorja pL. Protein CII pa aktivira izražanje genov, ki jih nadzoruje promotor pI. To rezultira v izražanju gena za integrazo, ne pa tudi gena za ekscizionazo. DNA integracija zato poteče. Predvideva se, da je pri zmedenih fagih, kljub poteku litičnega cikla, prisotna zadostna količina CII za izražanje genov, ki so pod nadzorom promotorja pI. Ta količina pa je najverjetneje premajhna, da bi aktivirala promotor pRE, ki bi povzročil potek zgolj lizogenega cikla. Posledično potečeta oba cikla in sicer se profagi najprej integrirajo v genom gostiteljske celice, nato pa poteče še litični cikel.

Medsebojni vpliv fagov

Pri poteku lizogenega cikla fagi med seboj sodelujejo, kar rezultira v integraciji različnih verig fagne DNA v gostiteljski genom. Sodelovanje fagov je pri pogojih, ki so neugodni za njihovo razmnoževanje, ugodno, saj tako skupaj spodbujajo integracijo. Ker litični cikel poteka predvsem pri pogojih, ki so ugodni za razmnoževanje fagov, ti pri poteku litičnega cikla med seboj tekmujejo. Dominanca omogoči maksimalno razmnoževanje, zato je večina novonastalih virusnih delcev genetskih potomcev dominantnega faga. Vzpostavitev dominance je posledica mnogih dejavnikov, kot sta na primer čas infekcije faga in sredstva gostiteljske celice.

Časovni potek okužbe in njegov vpliv na odločitev

In vitro študije so pokazale, da lahko izbrizganje fagne DNA v bakterijo traja od 1,5 s do 5 min. To je odvisno od tega ali je vstop potekal v enem koraku ali v več korakih z vmesnimi prekinitvami. V in vivo pogojih je bilo ugotovljeno, da čas izbrizganja fagne DNA zelo variira. Zaključili so, da je proces izbrizganja fagne DNA asinhron, razlikuje se tudi med različnimi sevi virusa. Poraja se novo vprašanje kako bi te razlike lahko vplivale na šum in posledično na sprejemanje odločitve. Okužba z virusom poteka v več stopnjah, preden fagi sprejmejo odločitev kateri cikel bo potekel. V eni celici lahko pride do interakcije med DNA različnih fagov, pri tem pa je ključen čas vstopa DNA v bakterijo. Ko fag okuži celico, se lahko zgodi, da je to celico pred njim okužil že kakšen drug fag. Fag, ki je prej okužil celico, lahko dominira nad zapoznelim fagom, saj je prvi fag že lahko začel lizirati celico. V celicah, kjer poteče lizogen cikel, so opazili, da prvi fag, ki okuži celico ni dominanten. Druga študija je pokazala, da kasneje kot fag okuži celico, manj sodeluje pri odločanju za izbiro cikla. Razlike v času, ki ga določen fag porabi, da njegova molekula DNA vstopi v celico, lahko povzročijo velike razlike pri tem koliko genov se je že izrazilo. To bi pomenilo, da je čas, ki ga fag porabi za prenos DNA v celico izredno pomemben.

Obdobje spremembe prvotne odločitve

Druge študije so pokazale, da lahko izražanje gena za protein, ki promovira litični cikel (protein Q), spremeni določitev, čeprav je bila že sprejeta odločitev za lizogenost. To nakazuje pomembnost časovnega poteka okužbe. Obstaja določen časovni interval znotraj katerega lahko fagi opustijo začetno odločitev za lizogenost in se vseeno uspešno razvije litični cikel. To se zgodi kot odziv na veliko količino poznega regulatorskega proteina Q. Prav tako v tem časovnem intervalu ne sme biti več aktiven CII protein. Če se koncentracija proteina CII dovolj hitro zmanjša, lahko to omogoči nakopičenje proteina Q.

Regulacija izražanja proteina Q je zelo pomembna. Če se protein Q nakopiči prehitro, se litični cikel razvije v razmerah, v katerih bi bila boljša izbira lizogenost. Zato obstaja določen časovni zamik med CI-Cro stikalom in izražanjem poznih genov s pomočjo proteina Q. 50 % celic so raziskovalci lahko zunanjim izražanjem proteina Q, po 50 minutah okužbe, preusmerili iz lizogenega cikla v litični cikel. Ko so večali časovni interval med okužbo in izražanjem proteina Q, se je manjšalo št. celic, ki so se preusmerile v litičnost.

Nakopičenje proteina Q in neaktiven protein CII lahko omogočata zamenjavo odločitve iz lizogenosti v litičnost. Trajanje obdobja neodločenosti je odvisno od časa transkripcije pR mRNA in hitrosti replikacije fagne DNA, saj mora biti za uspešen razvoj litičnega cikla prisotnih dovolj molekul fagne DNA.

Viri

Herskowitz I. in Hagen D. The Lysis-Lysogeny decision of phage λ: Explicit programming and responsivness. Annual Review of Genetics. 1980, 14, 399-445.

Semsey S., Campion C., Mohamed A. in Svenningsen S. L. How long can bacteriophage λ change its mind?. Bacteriophage. 2015, 5, 1, e1012930.

Shao Q., Trinh J. T. in Zeng L. High-resolution studies of lysis–lysogeny decision-making in bacteriophage lambda. Journal of Biological Chemistry. 2019, 294, 10, 3343–3349.

Shao, Q., Trinh, J. T., McIntosh, C. S., Christenson, B., Balazsi, G. and Zeng, L. Lysis‐lysogeny coexistence: prophage integration during lytic development. MicrobiologyOpen. 2017, 6,1, e00395.