POPRAVLJANJE Z IZCEPOM BAZE (BER)

Popravljanje z izcepom baze je eden izmed mehanizmov popravljanja okvar DNA na eni verigi. Gre za odstranjevanje kemično modificiranih baz, ki običajno nastanejo z deaminacijo, oksidacijo ali alkilacijo baz. Takšne vrste modifikacij sicer ne spremenijo drastično strukture DNA, vplivajo pa na zmožnost baze za tvorjenje vodikovih vezi in posledično na parjenje baz. Večina takšnih poškodb DNA nastane spontano, lahko pa jih povzročijo tudi razne okoljske kemikalije, sevanje ali zdravljenje z določenimi zdravili proti raku. Mehanizem BER začne encim DNA-glikozilaza, ki prepozna in odstrani poškodovano ali napačno bazo, tako da nastane abazično (AP) mesto. Nadaljnja pot se do konca lahko odvije po dveh različnih poteh: popravljanje preko kratkega segmenta (short-patch repair) ali popravljanje preko dolgega segmenta (long-patch repair), pri tem pa sodeluje veliko različnih proteinov. Preko mehanizma BER se tako odstranijo poškodovane baze, ki bi drugače lahko zaradi napačnega parjenja povzročile mutacije. Mehanizem popravljanja z izcepom baze (BER) ima torej pomembno vlogo pri preprečevanju nastanka raka, neurodegenerativnih bolezni in staranju.

Prva stopnja BER

V prvem koraku, ki je ključen pri mehanizmu BER, pride do izpostavitve poškodovane baze iz DNA s pomočjo encima DNA-glikozilaze, ki katalizira cepitev N-glikozidne vezi med poškodovano bazo in 2'-deoksiribozo, tako da na verigi nastane abazično (AP) mesto. Pri sesalcih poznamo vsaj 11 različnih DNA-glikozilaz, ki prepoznavajo različne vrste poškodb. Nekatere DNA-glikozilaze (npr. TDG, MBD4, OGG1) so bolj specifične in poškodovano bazo prepoznajo samo v dvoverižni DNA, druge (npr. UNG, SMUG1, NEIL1) pa lahko poškodovano ali napačno bazo prepoznajo tudi na enoverižni DNA. Obstajata dve vrsti DNA-glikozilaz: monofunkcionalne in bifunkcionalne. Monofunkcionalne so tiste, ki imajo samo glikozilazno aktivnost – torej odstranijo poškodovano bazo, tako da nastane AP mesto, ki predstavlja substrat za AP-endonukleazo (APE1). APE1 cepi fosfodiestrsko vez med AP mestom in nukleotidom v smeri 5', tako da nastaneta 3'-OH konec in nekonvencionalen 5'-deoksiriboza fosfat (5'-dRP). Monofunkcionalne DNA-glikozilaze za nukleofilen napad na N-glikozidno vez uporabijo molekulo vode. Bifunkcionalne DNA-glikozilaze imajo poleg glikozilazne aktivnosti še β–liazno ali β,δ-liazno aktivnost, zato takrat AP-endonukleaza ni potrebna. Za nukleofilen napad uporabijo amino skupino stranske verige lizina. Najprej torej odstranijo bazo in nato cepijo fosfodiestersko vez med AP mestom in nukleotidom v smeri 3'-konca. Produkta se razlikujeta od tistega, ki nastane pri delovanju monofunkcionalne DNA-glikozilaze in APE1. V primeru DNA-glikozilaz z β–liazno aktivnostjo pri cepitvi fosfodiestrske vezi nastane na 3'-koncu nenasičen hidroksialdehid in na 5'-koncu fosfatna skupina. V primeru, ko ima DNA-glikozilaza β,δ-liazno aktivnost, pride do cepitve fosfodiesterske vezi z obeh strani glede na AP mesto, pri čemer nastaneta 3'-fosfatni in 5'-fosfatni konec. V naslednjih korakih, kjer nastopita DNA-polimeraza in ligaza, mora biti na 3'-koncu hidroksilna skupina, na 5' koncu pa fosfatna. Če torej želimo, da pride do zapolnitve vrzeli na verigi DNA, moramo nekonvencionalne 3'- in 5'-konce , ki nastanejo pri cepitvi fosfodiestrske vezi, odstraniti. Za to poskrbijo različni encimi. Deoksiribozo fosfat (dRP) s 5'-konca, ki nastane pri delovanju monofunkcionalne DNA-glikozilaze in APE1, odstrani DNA-polimeraza β (Polβ), tako da dobimo ustrezen 5'-fosfatni konec. V primeru β-eliminacije APE1, ki ima poleg endonukleazne tudi 3'-fosfodiesterazno aktivnost, odstrani hidroksialdehid s 3'-konca, tako da nastane 3'-OH konec. V primeru β,δ-eliminacije pa 3'-OH konec nastane tako, da encim polinukleotid kinaza/fosfataza (PNKP) odstrani 3'-fosfat. Vsi intermediati so tako pripravljeni na naslednji korak mehanizma BER.

Druga stopnja BER

Nastali intermediati reagirajo po dveh različnih mehanizmih: popravljanje preko kratkega in dolgega segmenta oz. short- in long-patch repair (SP-BER in LP-BER). Pri SP- BER se zamenja le en nukleotid, medtem ko se pri LP-BER zamenja od 2 do 10 nukleotidov zapovrstjo na isti verigi. SP-BER je bolj pogost način popravljanja in ga najdemo tako pri celicah, ki so v procesu proliferacije, kot pri tistih, ki niso. Pri tem načinu so potrebni specifični proteini, ki pa ne sodelujejo v procesu replikacije DNA. Poleg tega, da Polβ odstrani dRP s 5'-konca, istočasno pripne ustrezen deoksiribonukleotid (dNTP) na 3'-OH konec vrzeli. Proces SP-BER se zaključi z DNA ligazo, ki združi sosednja 3'- in 5'-konca, pri čemer lahko sodelujeta DNA ligaza1 (LIG1) ali DNA ligaza3 (LIG3). Prva je prisotna pri SP-BER v jedru, medtem ko pri popravljanju mitohondrijske DNA sodeluje LIG3. LIG1 najdemo v kompleksu z DNA sponko PCNA (proliferating cell nuclear antigen), medtem ko LIG3 interagira s proteinom XRCC1(X-ray repair cross-complementing protein 1). Če je Polβ odsotna, jo lahko nadomesti tudi Polλ, ki je manj učinkovita pri vezavi na prekinjeno verigo DNA, vendar vseeno učinkovito zapolni vrzel. Mehanizem LP-BER je prisoten v celicah med proliferacijo. Za razliko od SP-BER so tu pomembni tudi proteini, ki sodelujejo pri replikaciji DNA. LP-BER poteka s pomočjo polimeraze δ (Polδ) in polimeraze ε (Polε), ki sta povezani s PCNA. Ta kompleks povzroči podaljševanje verige z dodajanjem pravilnih dNTP. Proces se imenuje sinteza z izpodrivom verige (ang. strand displacement synthesis). Ko polimeraza dodaja nukleotide na 3'-konec v vrzeli, na drugem koncu zapovrstjo izpodriva nukleotide. Na 5'-koncu se tvori ti. intermediat z zavihkom (ang. flap intermediat). Izpodrinjen del verige se nato odstrani s Flap endonukleazo (FEN1). Na 5'-koncu v vrzeli tako ostane fosfatna skupina, ki je ustrezen substrat za LIG1/PCNA. Ta spoji 3'- in 5'-konec skupaj ter tako zapolni vrzel. Pri LP-BER LIG3 ne sodeluje. Pri strand displacement synthesis lahko namesto Polδ in Polε sodeluje tudi Polβ, ki je torej lahko del SP-BER kot tudi LG-BER.

Izbira poti v drugi stopnji BER

Regulatorni sistem, ki določa po kateri poti se bo nadaljeval BER po tem, ko preide prvi korak, do sedaj še ni popolnoma raziskan. Osnovni princip temelji na tem ali Pol β lahko odstrani 5'-dRP. Če je to mogoče, bo mehanizem potekal po SP-BER, v nasprotnem primeru pa poteka po LP-BER. V zadnjih letih so odkrili različne dejavnike, ki vplivajo na regulacijo. V celicah navadno prevladuje SP-BER. Vseeno pa je LP-BER verjetno glavni mehanizem, po katerem poteka BER, ki ga sprožita DNA-glikozilazi UNG2 in NEIL1 v celicah po replikaciji. Vključitev novega nukleotida v popravljajočo se verigo ni odvisna od tega ali je celica v procesu proliferacije ali ne. Vseeno pa so ugotovili, da mehanizem v neproliferajočih se celicah raje poteka s pomočjo Pol β (SP-BER), v proliferajočih pa s pomočjo Polδ/ε (LP-BER). Poleg tega je izbira nadaljnjega poteka BER odvisna tudi od drugih stvari. Na mehanizem vpliva dostopnost BER faktorjev. Eden izmed njih je protein HMGB1, ki vpliva na potek različnih popravljalnih mehanizmov. Kadar je prisoten v celici, interagira s proteinoma APE1 in FEN1 in usmeri mehanizem po LP-BER. Na potek BER vpliva tudi koncentracija ATP v celici. Če bo ATP veliko, se bo mehanizem usmeril v SP-BER in ligacija z LIG3 bo potekla hitro. V nasprotnem primeru, ko bo koncentracija ATP nizka, bo potekel LP-BER.

Vloga BER pri razvoju bolezni

Ne glede na to, po kateri poti poteka BER, ima ta pomembno vlogo pri normalnem delovanju celic. Če pride do nepravilnosti v poteku popravljalnih mehanizmov, lahko to vodi v različna bolezenska stanja. Najbolj raziskana bolezen je rak. V 30% primerov raka, ki ni vrsta levkemije, so ugotovili, da je prišlo do mutacij v bralnem okvirju Polβ. Do genomskih nestabilnosti in celičnih transformacij pride tudi zaradi mutacij v katalitični domeni tega encima. Z nastankom raka so povezali tudi posledice delovanja reaktivnih kisikovih spojin (ROS), kar vodi v oksidativni stres. Pri teh vrstah poškodbe DNA ima BER veliko vlogo pri njihovem popravljanju. Gre za oksidativne poškodbe baz, med katerimi je zelo pogost nastanek 8-oksogvanina (8-oxoG), ki je močno mutagen. 8-oxoG prepozna bifunkcionalna DNA-glikozilaza 8-oksogvanin glikozilaza 1 (OGG1), ki ima β-liazno aktivnost. Poleg OGG1 je v zaščito pred ROS vpleten tudi MUTYH. Ta encim popravlja tiste poškodbe, ki jih OGG1 ne more. Pri preučevanju testnih miši so ugotovili, da se je ob odsotnosti encimov OGG1 in MUTYH zelo povečal razvoj pljučnega raka in raka na tankem črevesju. Vpliva oksidativnega stresa niso povezali samo z rakom ampak tudi z od staranja odvisnimi neurodegenerativnimi boleznimi. Pri regeneraciji celic sodeluje DNA-glikozilaza NEIL3, ki v diferenciranih celicah nima pomembnejše vloge. Vpletena je v popravilo napak, ki nastanejo zaradi oksidativnega stresa v proliferajočih se celicah možganov. V nekaterih primerih je lahko običajni popravljalni mehanizem škodljiv in vodi v razvoj bolezni. Tako je pri Huntingtonovi bolezni, ki se pojavi, ko se poveča število zaporedij CAG v zapisu za gen huntingtin. Ugotovili so, da delovanje OGG1 v tem primeru povzroči večje število ponovitev. Pri modelnih organizmih za Huntingtonovo bolezen so videli, da ob pomanjkanju tega encima, do ključnih ponovitev ni prišlo.

Viri

• Jacobs, A.L., Schär, P. DNA glycosylases: in DNA repair and beyond. Chromosoma, 2012, vol. 121, št. 1, str. 1– 20

• Krokan, H. E., Bjornas M. Base Excision Repair. Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 2013.

• Kim, Y. J., Wilson III, D. M. overview of Base Excision Repair Biochemistry. Curr Mol Pharmacol. 2012. Str.: 3.-13.

• Voet, D., Voet, J. G., Pratt, C. W. Principles of Biochemistry. 4th edition. John Wiley & Sons Singapore Pte. Ldt., 2013. ISBN: 978-1-11809244-6.