Popravljanje neujemanja

Popravljanje nujemanja

Popravljanje neujemanja (MMR - ang. mismatch repair) je eden izmed ključnih procesov pri ohranjanju genomske stabilnosti. MMR omogoči popravljanje dveh napačno povezanih komplementarnih baz ali dveh nevezanih baz, ki so nastale kot posledica delecije ali insercije med replikacijo in rekombinacijo DNA. Te napake so izjemno redke, saj DNA-polimeraza napačno veže le en nukleotid na vsakih 10^5 dodanih nukleotidov. Že sama DNA-polimeraza pa vsebuje tudi proofreading eksonukleazno aktivnost, ki zmanjša možnost napake še za 100-krat. Hčerinska veriga tako zapusti replikacijski kompleks z eno napako na 10^7 vezanih nukleotidov. Čeprav se zdi to zelo velika natančnost podvojevanja, za celico ni dovolj, saj je vsaka napaka na DNA potencialno škodljiva. MMR je eden od mehanizmov, ki skrbijo za še natančnejše podvojevanje, saj se z MMR možnost nepravilnosti pri podvojevanju in rekombinaciji DNA zmanjša še za dodatnih 100-krat, tako je končna verjetnost nastanka mutacije 1: 10^9.

Splošen mehanizem

Med organizmi obstajata dva različna mehanizma popravljanja neujemanja, vendar je v osnovi princip delovanja enak. Specifični proteini, drsijo po DNA in z naključnimi vezavami iščejo morebitne nukleotidne napake. Mutacije povzročijo konformacijske spremembe teh proteinov, kar nato sproži aktivacijo endonukleaz. Te razgradijo odsek DNA okoli nepravilnosti in tako omogočijo, da lahko DNA-polimeraza ponovno sintizira komplementarno verigo, temu pa sledi ponoven proofreading. Bistvena razlika med mehanizmom E. Coli in nekaterimi njej podobnimi bakterijami ter ostalimi organizmi pa je razlikovanje med matrično verigo in novo nastalo DNA verigo, ki vsebuje napačno sparjen nukleotidni par oz. insercijo/delecijo. Natančen mehanizem bo predstavljen v nadaljevanju seminarja.

Odsotnost MMR

Nepravilno delovanje MMR v celicah povzroča kopičenje mutacij v celici kar privede do različnih bolezenskih stanj. Eno izmed takih stanj je mikrosatelitska instabilnost (MSI microsatellite instability), kjer so DNA mikrosateliti na komplementarni verigi večkrat ponovljeni kot na matrični. Mikrosateliti so ponavljajoči se navadno od enega do 6 nukleotidov dolgi odseki DNA, ki se navadno nahajajo v nekodirajoči DNA. Težava nastopi, ko pride do mutacije mikrosatelita na kodirajoči verigi, saj pride takrat do fenotipskih sprememb. MSI je povzročitelj 15% vseh rakavih obolenj v prebavnem traktu, prav tako pa lahko povzroča tudi kožnega raka, raka urinalnega trakta in raka na možganih.

MMR pri E. coli

Prvotne raziskave in odkritja so potekale na modelnem organizmu E. Coli, čeprav so bili prvi geni za MMR odkriti pri S. pneumoniae. Z eksperimenti so bile uspešno karakterizirane vse komponente MMR, prav tako pa je bila ustvarjena tudi delujoča rekonstrukcija mehanizma in vitro. Pri popravljanju neujemanja pri E. coli sodeluje veliko proteinov, ki so funkcijsko in strukturno zelo raznoliki. Med glavnimi so Mut, DNA helikaza in eksonukleaze. Tak mehanizem imajo le še nekatere E. coli podobne bakterije, večina prokariontov in vsi evkarionti pa imajo drugačen mehanizem popravljanja, ki bo pojasnjen kasneje.

Prepoznavanje neujemanja

Najprej protein MutS prepozna nepravilno sparjena nukleotida na DNA kratka nukleotidna insercijska/delecijska neujemanja. Na DNA je vezan kot homodimer, ki na začetku počasi rotira po DNA in išče neujemanje nukleotidov, tako da z bazami vzpostavlja naključne kontakte. Neujemanje baz prepoznava motiv Phe-X-Glu na A podenoti MutS, ki z nesparjenima bazama tvori vezi. Ko MutS naleti na neujemanje, pride tam do kratkotrajne zaustavitve proteina, zaradi interakcij z napačno sparjeno bazo. MutS je tudi ATP vezavni protein. Na mestu mutacije se v nukleotid vezavno domeno ene podenote veže ATP, iz druge podenote pa oddisociira ADP. Posledično MutS doživi konformacijsko spremembo v obliko drseče sponke. Po preurejanju strukture je DNA vezana v bolj ohlapnem žepu kot pred spremembo, kar omogoča hitrejšo difuzijo MutS po DNA, poleg tega pa je v novi konformaciji približno 30x zmanjšana hidrolitična aktivnost MutS. To je tudi razlog, da je nova konformacija stabilizirana na mestu neujemanja, saj je hidroliza ATP precej zmanjšana. Zanimivo je, da se na mestu neujemanja ADP iz MutS sprosti 10-30x hitreje kot na pravilno sparjeni DNA, kar je ključno stikalo za začetek popravljanja neujemanja.

Razločevanje hčerinske verige

V naslednjem koraku protein MutL v obliki homodimera interagira z MutS, vezanim na DNA. Kompleks MutS-MutL od mesta mutacije oddifundira po DNA v 3' ali 5' smeri in ima sposobnosti vezati in aktivirati MutH. MutH je endonukleza, ki pri pri E. coli poskrbi za razločevanje materinske verige od hčerinske. MutH prepozna in se veže na tetranukleotidne motive d(GATC), ki so pri E. coli metilacijska mesta. Ker je komplementarni motiv d(CTAG) ravno obraten od izvornega, so metilacijska mesta na obeh verigah prisotna na isti lokaciji. Delovanje metilaz, ki skrbijo za metilacijo DNA na d(GATC) zaostaja za delovanjem DNA polimeraze za približno 2 minuti, zaradi česar je v tem času DNA metilirana zgolj na materinski verigi.To izkoristi MutH, saj se veže izključno na polovično metilirana d(GATC) mesta in tako poskrbi za prepoznavanje hčerinske verige.

Zaključitev popravljanja

Kompleks MutS-MutL potuje po DNA od mesta mutacije in išče najbližje mesto, kjer je vezan MutH. Ko pride do interakcije med MutH, vezanim na d(GATC), in drsečim kompleksom MutS-MutL, se MutH aktivira in cepi hčerinsko verigo DNA v motivu d(GATC). Po rezanju DNA MutL rekrutira helikazo UvrD, ki razvije dvoverižno DNA od mesta zareze proti mestu mutacije. Na novo nastalo enoverižno DNA se vežejo SSB proteini in jo stabilizirajo, ter eksonukleaza, ki razgradi hčerinsko verigo DNA od zareze do mesta mutacije. Ker je najbližje d(GATC) mesto lahko v 3'- ali 5'-smeri od mesta mutacije, za razgradnjo DNA potrebujemo dve različni eksonukleazi. V primeru, da je najbližji MutH vezan v 5'-smeri od mutacije v razgradnji sodeluje 5'→3' eksonukleaza, v nasprotnem primeru pa 3'→5' eksonukleaza. Po delovanju eksonuklaze vrzel v DNA zapolni holoencim DNA-polimeraza III, ki sintetizira DNA od 5'-konca vrzeli proti njenemu 3'-koncu. Zadnji nukleotid, ki ga doda DNA polimeraza III, z ostalo hčerinsko verigo poveže DNA-ligaza. V primeru, da je napaka popravljena nato s krajšim časovnim zamikom deoksiadenozin metilaza dokončno metilira adenin v d(GATC) mestu.

MMR pri človeku

Kot je bilo omenjeno je bistvena razlika pri popravljanju neujemanja E. Coli in ostalih prokariontov ter evkariontov razlikovanje med matrično in novo nastalo mutirano DNA verigo. Specifičen signal za razlikovanje predstavljajo prehodne zareze na 3' koncu vodilne verige in med Okazakijevimi fragmenti. Pri tem ima ključno vlogo tudi drsna vponka PCNA.

MutS in MutL homologi:

Pri prepoznavanju napak sodelujejo heterodimeri MutS homologov (MSH2, MSH3, MSH6). Dimer MSH2-MSH6 se imenuje MutSα in prepozna neujamanje v enem baznem paru ali krajše insercijske/delecijske zanke (1-2 nesparjen nukleotidni par). Dimer MSH2-MSH3 oz. MutSẞ prepozna le daljše insercijske/delecijske zanke (2-10 baz). Poznani so 4 MutL homologi: MLH1, MLH3, PMS1 in PMS2. Ključno vlogo pri popravljanju ima dimer MLH1-PMS2 oz MutLα. Ostala dva dimera MutLẞ (MLH1-PMS1) in MutLγ (MLH1-MLH3) sta manj raziskana. MutH homologov pri evkariontih ni, njihovo endonukleazno aktivnost pa zato vsebuje MutLα, in sicer podenota PMS2.

Kompleksen MMR usmerjen z 3' ali 5' zarezo

MutSα prepozna in se veže na napačen nukleotid z dobro ohranjenim Phe-X-Glu zaporedjem v podenoti MSH6, pri tem pa ukrivi DNA vijačnico. Temu sledi zamenjava ADP z ATP na MSH6 in preureditev MutSα v bolj odprto konformacijsko obliko, ki omogoči nadaljnje drsenje MutSα po DNA. Na kompleks MutSα-ATP-DNA se nato veže MutLα. Ta na predhodno zarezani verigi uvede novo zarezo, stran od napačno sparjenega nukleotidnega para. Zato da MutLα zareže pravo verigo, je zaslužna drsna vponka PCNA. Le-ta se namreč s pomočjo nalagalca RFC veže na že obstoječo zarezo in interagira z MutSα-MutLα kompleksom. Glede na to, kako se PCNA orientira okrog obstoječe zareze, je določena smer, v katero bo MutLα uvedla novo zarezo. Ko je predel z napako zarezan iz obeh strani, svoje delo opravi še eksonukleaza. Pri evkariontih sodeluje le ena eksonukleaza EXO1, ki del z napačno sparjenim nukleotidom vedno izreže v smeri 5' proti 3'. Na predel ssDNA se veže RPA, ki DNA stabilizira in onemogoči nadaljno hidrolizo. Nov del verige sintetizira DNA polimeraza δ. Zadnji korak v popravljanju pa vključuje DNA ligazo I, ki nov del verige tudi poveže z že obstoječo verigo. Shematski prikaz je dostopen tukaj.

Enostaven MMR usmerjen z 5' zarezo

Ta mehanizem je verjetno značilen za popravljanje napak na zastajajoči verigi med Okazakijevimi fragmenti. Vezava MutSα na napačno sparjen nukleotidni par aktivira eksonukleazo EXO1, ki hidrolizira zarezano verigo z napačno bazo v smeri od 5'-konca proti 3'-koncu. V tem primeru aktivnost MutLα ni potrebna. Nadaljni proces sinteze novega dela je enak prejšnjemu.

Viri

[1] Li, G.-M. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Res. 18, 85–98 (2008).

[2] Porter, G., Westmoreland, J., Priebe, S. & Resnick, M. A. Homologous and homeologous intermolecular gene conversion are not differentially affected by mutations in the DNA damage or the mismatch repair genes RAD1, RAD50, RAD51, RAD52, RAD54, PMS1 and MSH Genetics 143, 755–67 (1996).

[3] Groothuizen, F. S. et al. MutS/MutL crystal structure reveals that the MutS sliding clamp loads MutL onto DNA. Elife 4, e06744 (2015).

[4]      P. Modrich, ”Mechanisms in eukaryotic mismatch repair,” J Biol Chem, 2006. 281(41):30305-30309.

[5]      B.E. Tropp: Principles of Molecular Bilogy, 1. izdaja. Burlington: Jones & Bartlett Learning, 2014.