Nehomologno povezovanje koncev

Dvojnoverižni zlomi DNA in njihovo popravljanje

Vsak dan se v človeškem genomu zgodi okoli 10 000 poškodb DNA, med katerimi so najbolj nevarni dvojnoverižni zlomi (DSB, "Double Strand Breaks"). Če se ti ne popravijo pravilno, lahko pride do celične senescence, apoptoze in različnih kromosomskih napak (kot so na primer translokacije in delecije). DSB-ji se popravljajo na dva načina - preko mehanizma nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ, "Nonhomologous End Joining") ali pa preko mehanizma homologne rekombinacije (HR, "Homologous Recombination"). Pri mehanizmu nehomolognega povezovanja koncev gre za direktno ligacijo zlomljene molekule DNA, proces pa je neodvisen od nukleotidnega zaporedja na zlomljenih koncih. Za razliko od popravljanja dvojnoverižnihih zlomov DNA preko homologne rekombinacije, ta mehanizem ne potrebuje homologne molekule DNA kot matrice za popravilo poškodovane DNA in zato ni odvisen od faze celičnega cikla. Mehanizem preko homologne rekombinacije je namreč možen samo, ko je na voljo sestrska kromatida - to pa je med S in G2 fazo celičnega cikla.

Protein Ku in njegova vloga pri NHEJ

Popravljanje preko nehomolognega povezovanja koncev se začne z vezavo proteina Ku na mesto zloma. Ku je heterodimerni protein, sestavljen iz podenot Ku70 in Ku80, ter se nahaja v jedru. Ima sposobnost zelo hitre lokalizacije in vezave na DSB. Razlogi za to so njegova zelo velika afiniteta za konce DNA, visoka koncentraciji v celici in nespecifičnost za zaporedja ob zlomih. Njegovi podenoti se razlikujeta v aminokislinski sestavi, vendar imata podobno sekundarno in nativno strukturo. Sestavljeni sta iz treh domen: N-končne (von Willebrandove) iz alfa-heliksa in beta-sodčka, centralne domene, ki je potrebna za dimerizacijo podenot in vezave na DNA, ter C-končne domene, ki jo sestavlja alfa-heliks. Dimer podenot tvori obroč, ki s centarlnima domenama obda molekulo DNA. Protein Ku se tako na mestu zloma naniza na DNA in se pritrdi na sladkorno ogrodje vijačnice (zato nespecifičnost za zaporedja pri zlomih) preko C-končne domene podenote Ku70. Ku nato rekrutira ostale popravljalne faktorje. S C-končno domeno na podenoti Ku80 interagira z DNA-PK (od DNA odvisna kinaza) in ji omogoči vezavo na DNA. Na vijačnico se naloži s pomočjo N-končne levcinske zadrge. DNA-PK se sicer lahko tudi sama veže na DNA, vendar Ku poveča hitrost vezave približno stokrat. C-končna domena DNA-PK glede na N-končno tvori klešče, skozi katere gre molekula DNA. Interakcija DNA-PK z DNA povzroči premik proteina Ku naprej po dvojni vijačnici in tudi samo aktivacijo DNA-PK. Ku nato rekrutira tudi ligazni kompleks, ki je sestavljen iz DNA ligaze IV, XRCC4 in XLF. DNA ligaza IV in XLF interagirata s celotnim heterodimerom Ku, medtem ko se XRCC4 specifično veže le na podenoto Ku70. XRCC4 nima encimske aktivnosti. Poveže se s XLF, pomen tega pa je stabilizacija zlomljenih koncev DNA. Pri procesu ima pomembno vlogo tudi protein APLF, ki zadržuje proteine XRCC4, XLF in DNA ligazo IV na mestu poškodbe.

D-NHEJ in vloga DNA-PK

Obstajata dve različici popravljalnega mehanizme preko nehomolognega povezovanja koncev: D-NHEJ ("DNA-PK" NHEJ) in B-NHEJ ("Backup" NHEJ). D-NHEJ je najpogostejši mehanizem, ki je odvisen od DNA-PK. Prej opisani protein Ku, ki se je vezal na konce DSB-ja, v kompleksu Ku-DNA privlači katalitično podenoto od DNA odvisne protein kinaze (DNA-PKcs) in s tem tvori DNA-PK holoencim. DNA-PKcs je serin/treonin protein kinaza, ki spada v družino PIKK (»Phosphatidylinositol-3 Kinase-like Kinase Family«), katere članici sta še ATM in ATR. N-terminalna regija DNA-PKcs sestoji iz HEAT ponovitev (»Huntington-elongation-A-subunit-TOR«), ki služijo kot področja za medproteinsko povezavo in oblikujejo karakteristično obliko proteina v obliki klešč. C-terminalna regija pa vsebuje PI3-kinazno domeno, ki je odgovorna za fosforilacijo. Obadajata jo za PIKK značilni domeni: v N-terminalno smer domena FAT (»FRAP-ATM-TRAPP«), v C-terminalno smer pa FATC (»FAT-C-terminal«).

DNA-PKcs je sposobna fosforilacije različnih proteinov, ki so ključni za uspešno ligacijo DSB-ja: RPA2, WRN, Artemis, XLF, XRCC4, DNA ligaze IV, fosforilira pa tudi sama sebe - avtofosforilacija. Ta se zgodi na več mestih, a najpomembnejša naj bi bila 2056-serin in 2609-treonin (slednje lahko fosforilirata poleg DNA-PK tudi ostala prej omenjena predstavnika družine PIKK). Z avtofosforilacijo pride v DNA-PKcs do konformacijske spremembe v FAT in FATC domeni. Posledica tega naj bi bilo odprtje klešč in sprostitev DNA-PK z DNA. Taka sprememba dovoli procesiranje koncev, polimerizacijo in v končni fazi tudi ligacijo z DNA ligazo IV. Ligaza IV sicer ima samostojno aktivnost, vendar ji pri zlepljanju DSB-jev pomagata dva faktorja: XRCC4 (»X-ray repair cross-complementing protein 4«), ki jo stabilizira ter s tem poveča njeno aktivnost in XLF ("XRCC4-like factor", znan tudi kot Cernunnos ali NHEJ faktor 1), ki interagira z XRCC4-LigIV. Kot že omenjeno, vse te tri faktorje na mesto poškodbe veže protein Ku. Ta direktno interagira z BRCT domeno ("BRCA1 (breast cancer-associated protein 1) C-terminal") DNA ligaze IV in omogoči, da se kompleks XRCC4-LigIV naloži na mesto poškodbe. Poleg XLF, s kompleksom XRCC4 interagira tudi APLF (»Aprataxin-and-PNK-Like Factor«). Ugotovili so, da odsotnost APLF močno upočasni proces popravljanja. Povezuje se namreč tako s proteinom Ku kot s kompleksom XRCC4-LigIV, s čimer zagotavlja stabilnost tega kompleksa na mestu poškodbe in zaradi tega tudi pospešuje ligacijo. Kompleks XRCC4-LigIV je pomembnen tudi za rekrutiranje DNA polimeraz, ki so potrebne pri procesiranju koncev.

Vloga DNA-PK je pomembna tudi po končani ligaciji - s fosforilacijo odstrani faktorje, ki niso več potrebni, ostane le še protein Ku, ki je kot nekakšna zaponka, ki se ne more več odpeti. Odstranitev z DNA mu omogoči poliubikvitinacija. Podenoto Ku80 poliubikvitinira Skp1-Cu11-Fbx112 preko K48-povezave. Skp1-Cu11-Fbx112 je t.i. SCF oz. E3 ubikvitin ligaza.

Procesiranje koncev

Ligaza IV je zmožna spojiti le fragmente DNA, ki imajo ohranjen 3' hidroksilni in 5' fosfatni konec. Ker pa pri zlomu dvojne vijačnice pogosto prihaja do poškodb na koncih, je pred ligacijo navadno potrebno procesiranje kocev. Procesiranje koncev je proces, v katerem vrsta encimov odstrani poškodovane ali napačne nukleotide, razdre strukture, ki ovirajo ligacijo, ter resintetizira manjkajoče dele v verigah, tako da ustvarijo kompatibilne konce.

Vrste kompleksnih koncev

Kompleksni konci so vsi konci, ki niso povezljivi. Taki so na primer ohranjeni 3' fosfatni ali 5' hidroksilni konci, ter konci s poškodovanimi nukleotidi. Najpogosteje prihaja do oksidacije baz ter do nastanka abazičnih (AP) mest, t.j. mest na DNA, ki nimajo niti purinskih, niti pirimidinskih baz. Konci se lahko zvijejo tudi v sekundarne strukture, kakršne so lasnične zanke, ali pa po poravnavi para koncev pride do neujemanj v nukleotidnem zaporedju, presledkov in »flap« struktur.

Glavni encimi in njihovo delovanje

Nekateri encimi, ki sodelujejo pri procesiranju koncev v NHEJ poti, so Artemis, PNKP, APLF, Polimerazi μ in λ, Werner (WRN), aprataksin in Ku. Potrebne encime na nepovezljive konce usmeri Ku-XRCC4 kompleks.

3' fosfatne in 5' hidroksilne konce popravlja encim PNKP, ki ima hkrati kinazno in fosfatazno aktivnost. S svojo kinazno domeno doda fosfatno skupino na 5' OH in s fosfatazno domeno s 3' konca odstrani fosfat. Tako ustvari povezljiva konca, ki jih lahko združi DNA ligaza IV.

V NHEJ sodeluje več nukleaz. Najpomembnejša med njimi je Artemis, ki ima veliko različnih nukleolitskih aktivnosti. 5' proti 3' endonukleazna aktivnost, ji omogoča, da odreže 5' lepljivi konec in ustvari dvoverižni topi konec. Artemis lahko odstrani tudi 3' fosfoglikolatne skupine z DNA koncev in odpre 5' proti 3' lasnične zanke. Artemis postane endonukleazno aktivna šele po tvorbi kompleksa in fosforilaciji z DNA-PKcs. Endo- in eksonukleazno aktivnost imajo tudi MRN, SETMAR, APLF in WRN. WNR na primer deluje kot 3' proti 5' eksonukleaza in APLF kot 3' proti 5' endonukleaza.

Pomembne pri procesiranju so tudi hidrolaze in liaze. V NHEJ sodeluje aprataksin (nukleotidna hidrolaza), ki odstranjuje adenilatne skupine, kovalentno vezane na 5' fosfatni konec. Ku protein ima liazno aktivnost in je sposoben izrezati AP mesta, blizu mesta zloma.

Med samim zlomom in zaradi delovanja nukleaz med procesiranjem v DNA zaporedju nastanejo presledki. Te zapolnjujeta polimerazi μ in λ. Obe lahko izvajata matrično odvisno sintezo, polimeraza μ pa ima v fizioloških razmerah tudi pomembno matrično-neodvisno aktivnost. Tako naključno dodajanje nukleotidov na konce DNA povzroči mikrohomologije, ki so poseben mehanizem nehomolognega povezovanja koncev. Poleg polimerazne pa ima polimeraza λ še pomemno liazno aktivnost, ki ji omogoča odstranjevanje poškodovanih baz.

B-NHEJ

Kadar zaradi različnih vzrokov DNA-PK ni prisotna, poteka t.i. »backup« NHEJ, ki je v primerjavi z D-NHEJ počasnejše, bolj nagnjeno k napakam (povezovanje napačnih koncev) in veliko manj pogosto v celici, poleg tega pa je B-NHEJ odvisen tudi od faze celičnega cikla. Procesiranje konca je obsežnejše, delecije in translokacije za uspešno NHEJ potekajo več nukleotidov stran od DSB-ja. Za razliko od D-NHEJ, se tukaj najprej na DNA veže PARP-1 (poli-(ADP-riboza) polimeraza), MRN ("Mre11–Rad50–Nbs1") proteinski kompleks pa poskrbi za procesiranje koncev. Histon H1 deluje kot stimulatorni faktor in je odgovoren za poravnavo (podobno kot Ku protein pri D-NJEH). V zadnjem koraku, ligaciji, pa naj bi WRN in XRCC1 pomagala ligazi III pri zlepljanju koncev (morda tudi ligaza I). Za zlepljanje je odgovoren kompleks LigIII/XRCC1/PARP1. Ku70/80 v D-NHEJ naj bi se vezal z veliko večjo afiniteto na DNA kot histon H1 in PARP1 v B-NHEJ, kar razloži pogostejše D-NHEJ popravljalne mehanizme kot B-NHEJ.

Klinični pomen nehomolognega povezovanja koncev

Popravljanje DSB z NHEJ pogosto vodi do kratkih insertov ali delecij na mestu zloma. Ta lastnost je vodila k poskusom uporabe NHEJ v zdravljenju osebkov, okuženih z virusom HIV. V T-celicah so delovali z nukleazo, zasnovano, da reže v CCR5 regiji gena, ki kodira za koreceptor za virus HIV. Popravilo zloma z NHEJ je ustvarilo celice z mutacijo v CCR5 regiji, ki so bile odporne na infekcijo z virusom. Pomembno je bilo tudi odkritje, da je NHEJ nadpovprečno aktiven v rakavih celicah, za katere je splošno značilna genomska nestabilnost. Genomska nestabilnost je vzrok za invazivnost in hiter razvoj tumorskih celic. Raziskava je pokazala, da inhibicija DNA ligaze IV resnično ovira širjenje tumorjev pri rakavih miših. Ti podatki kažejo na pomembnost NHEJ v celici in na možnost širše uporabe agentov, sodelujočih pri NHEJ, v medicinske namene.

Viri

1. Davis, A. J. in Chen, D. J. DNA Double Strand Break Repair via Non-Homologous End-Joining. Translational Cancer Research. 2013, letnik 2, št. 3, str. 130-143.
2. Fell, V. L. in Schild-Poulter, C. The Ku Heterodimer: Function in DNA Repair and Beyond. Mutation Research. 2015, letnik 763. str. 15-29.
3. Davis A.J., Chen B.P.C. in Chen D.J. DNA-PK: a dynamic enzyme in a versatile DSB repair pathway. DNA Repair. 2014, 17:21-29.
4. Mladenov E., Iliakis G. Induction and repair of DNA double strand breaks: The increasing spectrum of non-homologous end joining pathways. Mutat Res. 2011, 711:61-72.
5. Strande N. T., Waters C. A. in Ramsden D. A. Resolution of complex ends by non-homologous end joining - better to be lucky than good? Genome Integrity. 2012 3:10.