Vloga p53 pri ohranjanju genoma

p53 je tumor supresor, ki pogosto dobiva naziv varuha genoma, saj ima pomembno vlogo pri vzdrževanju integritete celičnega genoma.

STRUKTURA p53

Je molekula, sestavljena iz 4 identičnih proteinskih verig. V osrednjem delu p53 je tetramerizacijska domena, ki povezuje vse štiri verige. Sledi ji dalja fleksibilna regija, ki se nato poveže z naslednjo stabilno domeno, t.j. DNA vezavna domena. Tretja stabilna domena verige je transaktivacijska, ki je pozicionirana na koncu vsake roke. P53 se na DNA veže s pomočjo vseh štirih rok, na vezavno domeno, ki je običajno zgrajena iz naslednjih komponent:

1.) specifično vezavno mesto za dve od štirih domen p53, ki vežejo DNA,

2.) variabilen del dolg 0 do 13 baznih parov,

3.) drugo specifično vezavno mesto za drugi dve od štirih domen p53, ki vežejo DNA.

POŠKODBA DNA

Ob poškodbi DNA, ki je lahko posledica raznovrstnega stresa (sevanje, hipoksija, pomanjkanje ribonukleozid trifosfatov), kateremu je celica izpostavljena, začnejo delovati proteini, ki aktivirajo p53 bodisi preko fosforilacije ali z inhibicijo ubikvitinacija ki jo povzroča Mdm2. Tako fosforilacija kot preprečitev ubikvitinacija pomenita povišano raven p53, zaradi samega podaljšanja razpolovne dobe proteina. Kaskada dogodkov se nadaljuje z različnimi modifikacijami s strani acetiltransferaz in metiltransferaz, ki nadaljno zagotovijo stabilizacijo p53 in povečajo specifičnost vezave p53 na DNA. Temu sledijo številni koraki, ki lahko inhibirajo delovanje p53 ali pa pride do mobilizacije kofaktorjev in nadaljne transaktivacije tarčnih genov proteina p53. Vsi dogodki vodijo k cilju, ki je popravljanje DNA, zaustavitev celičnega cikla, senescenca ali pa apoptoza.

ZAUSTAVITEV CELIČNEGA CIKLA

Ena izmed pomembnih vlog p53 je njegova regulacija celičnega cikla. Ob poškodbi DNA pride do fosforilacije p53 s strani različnih možnih protein kinaz, ki modificirajo N-končno domeno, kar p53 omogoči, da aktivira transkripcijo specifičnih genov. Posledica tega lahko pomeni ustavitev celičnega cikla preden sploh pride do replikacije DNA v fazi G1, ali pa zaustavitev pred mitozo v fazi G2. Gre torej za inhibicijo nadaljevanja celičnega cikla v različnih kontrolnih točkah. Kot primer lahko vzamemo zaustavitev v kontrolni točki G1, ki je posledica transaktivacije waf1 gena, ki kodira kinazni inhibitor p21. Ta prepreči, da bi cikel šel v S fazo, tako, da blokira aktivnost od ciklina odvisne kinaze ali Cdk (“Cyclin-dependant kinase”). To so evolucijsko zelo dobro ohranjena družina protein kinaz, ki vežejo molekule imenovane ciklini in s tem aktivirajo lastno kinazno aktivnost. Cdk-ciklin kompleksi omogočajo napredovanje preko kontrolnih točk v celičnem ciklu.

V G1 fazi pride do akumulacije visokih ravni Cdk2-ciklin E kompleksov, ki se inaktivirajo, ko z njimi interagira p21, ki je, kot omenjeno, prisoten, ko pride do poškodbe DNA. P21 pa inhibira tudi kompleks Cdk4/6-ciklin D. Ko ta kompleks ni fosforiliran, ima kinazno aktivnost in fosforili pRb, ki je tako neaktiven. Neaktiven kompleks Cdk2,4/ciklin D pomeni, da je retinoblastoma protein (pRb) aktiven in opravlja funkcijo inhibicije E2F. E2F je namreč transkripcijski faktor in zagotavlja sintezo produktov, potrebnih za nadaljevanje celičnega cikla (na primer ciklin E, ciklin A in tudi transkripcijo samega sebe). Ob prisotnosti p21 celica torej ne more napredovati v fazo S.

POPRAVLJANJE DNA

p53 pa ne sodeluje le pri zaustavitvi celičnega cikla, temveč tudi pri samem popravljanju DNA. Ta sposobnost izhaja iz lastnosti osrednje domene p53. p53 ima sposobnost interakcije z DNA na mnoge različne načine: vezava na tako dvoverižno kot enoverižo DNA, na Hollidayjeve stike in na izbokline DNA, ki nastanejo zaradi napačno podvojenega dela DNA. Napačno zaporedje je lahko posledica mutacije enega nukleotida, bodisi zaradi zamenjave, delecije ali insercije. Druga pomembna in znana biokemijska aktivnost p53 je njegova intrinzična 3'->5' eksonukleazna aktivnost. Eksonukleaze so pomembne pri podvajanju in popravljanju DNA ter pri rekombinaciji. p53 lahko prepozna napako in zamenja napačen nukleotid, ali pa popravi prelom dvoverižne DNA. Zaradi takega kontrolnega branja je pri osebkih z motnjami na p53 večja verjetnost, da pride do mutacije, prav tako pa je zaradi nezmožnosti zaustavitve cikla večja verjetnost, da bo neka mutacija razvila raka. Vemo, da p53 deluje tudi kot transkripcijski faktor in omogoči izražanje drugih popravljalnih proteinov. Pomemben primer takega popravljalnega proteina je ribonukleotid reduktaza p53R2, ki se nahaja v jedru. Funkcija tega proteina je redukcija ribonukleotidov (NTP) v deoksiribonukleotide (2'-dNTP). Ta reakcija je pomembna za omogočanje zadostne količine nukleotidov tako pri replikaciji kot pri popravljanju DNA. dNTP so potrebni za vgradnjo v dvojno vijačnico na mesto napačno sparjenih baz. V primeru motnje p53, ko je aktivacija p53R2 neuspešna, se poveča frekvenca napačno sparjenih nukleotidov in genomska nestabilnost. To so potrdila dognanja, da je pri celicah s slabo ribonukleotid-redukcijo večji deleže celic, ki podležejo intrinzično sproženi apoptozi. Ko govorimo o vlogi p53 pri popravljanju DNA, pa moramo upoštevati tudi njegovo delovanje v neinduciranem stanju. Aktivno sodelovanje p53 pri popravljanju DNA ni omejeno le na dogodke, kjer pride do napak zaradi zunanjega stresa. Omenili smo gen waf1, kot enega izmed glavnih tarčnih genov p53 in njuno sodelovanje pri zaustavitvi celičnega cikla. Čeprav je dejstvo, da waf1 igra pomembno vlogo pri zaustavitvi celičnega cikla v točki G1 ob poškodbi DNA, se je vseeno izkazalo, da pri miših, ki so jim ta gen izbili, ne pride do povečane frekvence mutacij. p53, ki ni aktiviran kot posledica poškodbe DNA, ne mora zagotoviti transaktivacije specifičnih genov, saj je to posledica posttranslacijskih modifikacij, do katerih pride zaradi poškodbe. Vseeno pa lahko sklepamo, da ima p53 nekakšno funcionalnost, ki prepreči akumulacijo mutacij. To naj bi p53 dosegal s svojo 3'-5' eksonukleazno aktivnostjo oz. kontrolnim branjem, ki skrbi za preprečitev napak pri DNA replikaciji, ne le, ko pride do poškodb.

SPROŽITEV APOPTOZE

Kot odgovor na poškodbo pa p53 lahko sproži tudi apoptozo. Sprožitev intrinzične poti apoptoze je proces, na potek katerega prav tako vpliva p53 in je reverzibilna. Točka brez povratka je za celico aktivacija efektorske kaspaze 3, saj takrat pride do razgradnje celičnih proteinov. Mehanizem sprožitve je tudi tu transkripcijska aktivacija genov, in sicer za Bax in Apaf1 (apoptotsko proteazo aktivirajoč faktor 1), s strani p53. Bax je protein iz družine apoptotskih faktorjev Bcl-2 in povzroči premik citokroma c z membrane mitohondrija v citosol, kjer se poveže z Apaf1 in prokaspazo 9. Slednja se ob povezavi teh treh v tako imenovani apoptosom aktivira in lahko aktivira kaspazo 3, ki pa je glavni efektorski encim apoptoze. Lahko bi rekli, da je sprožitev apopoze dobro regulirana, saj se zaradi p53 poveča izražanje obeh faktorjev posredno potrebnih za sprožitev apoptoze, ne pa izražanje prokaspaze same. Kot omenjeno, sprožitev procesa apoptoze ni dokončna in je odvisna od uspešnosti poprave DNA; če je le-ta uspela, se p53 deaktivira, kar povzroči, da ostanejo efektorske kaspaze (kaspaze 3, 6 in 7) neaktivne.

REGULACIJA p53

Regulacija p53 je bistvena, saj pretirano izražanje pomeni prekomerno apoptozo, na drugi strani pa zmanjšana aktivnost lahko pomeni razvoj raka. Že na začetku smo omenili Mdm2, ki je glavni antagonist in regulator aktivnosti p53. Gre za ubikvitin ligazo, specifično za p53, ki veže in onesposobi p53 v jedru in ga prenese v citosol, kjer gre v razgradnjo v proteasom, saj ima določene lizine označene z poliubikvitinskimi verigami. Njegovo izražanje regulira p53 sam, torej gre za negativno povratno zvezo, kar je smotrno, glede na to, da celica želi koncentracijo p53 v nestresnih obdobjih vzdrževati na minimumu. Nizke koncentracije so zagotavljene tudi preko njegove nizke razpolovne dobe, ki traja le nekaj minut. Stabilizacija tega proteina ob pojavu potencialne onkogene grožnje je fosforilacija N-končne domene p53, ki onemogoči interakcijo z Mdm2, hkrati pa to predstavlja aktivacijo proteina kot transkripcijskega faktorja. Fosforilacija p53 pomeni odpornosti na Mdm2, kar pomeni da koncentracija p53 naraste, zaradi regulacije transkripcije pa posledično naraste tudi koncentracija Mdm2, a ta na fosforiliran p53 nima učinka. Čim pride do poprave mutacije na DNA, se protein kinaze inaktivirajo, p53 je v manjši meri fosforiliran in zato ga akumulirani Mdm2 v hipu pošlje v razgradnjo. Kot odziv na stres, ki povzroča motnje v dednem zapisu, se torej poveča razpolovni čas p53 in dvigne njegova koncentracija, prav tako pa se aktivira in stabilizira s fosforilacijo in lahko tudi z drugimi modifikacijami

p53 torej preprečuje širjenje poškodovanega dednega materiala, ki nosi potencialno onkogene mutacije. Njegove tri funkcije pri vzdrževanju integritete genoma so preprečitev celične delitve, sprožitev poprave DNA in sprožitev apoptoze, hkrati pa kaže aktivnost tudi v neinduciranem stanju. Motnje tega proteina lahko pomenijo pojav pretirane proliferacije celic oziroma nastanek raka.

VIRI

- https://en.wikipedia.org/wiki/P53

- http://www.bioinformatics.org/p53/introduction.html

- Moll, U. and Petrenko, O. (2003). The MDM2-p53 Interaction. Molecular Cancer Research, [online] 1(14), pp.1001-1008.

- T. Mummenbrauer, F. Janus, B. Müller et al. (1996). p53 Protein Exhibits 3′-to-5′ Exonuclease Activity. Cell, Volume 85, Issue 7, p1089-1099

- Geske, F., Nelson, A., Lieberman, R., Strange, R., Sun, T. and Gerschenson, L. (2000). DNA repair is activated in early stages of p53-induced apoptosis. Cell Death Differ, 7(4), pp.393-401.

- Yamaguchi, T., Matsuda, K., Sagiya, Y., Iwadate, M., Fujino, M., Nakamura, Y. and Arakawa, H. (2001). p53R2-dependent Pathway for DNA Synthesis in a p53-regulated Cell Cycle Checkpoint. Cancer Research, [online] 61(22), pp.8256-8262.

- F. Janus, N. Albrechtsen, I. Dornreister, et al. (1999). The dual role model for p53 in maintaining genomic integrity. Cellular and Molecular Life Sciences, Volume 55, Issue 1, pp. 12-27

- N. Albrechtsen, I. Dornreister, F. Grosse, et al. (1999). Maintenance of genomic integrity by p53: complementary roles for activated and non-activated p53. Oncogene, Volume 18, Issue 53, pp. 7706-7717