Strategije v boju proti biofilmom

Uvod

Biofilm je populacija mikroorganizmov, ki živi v organizirani strukturi, v kateri so celice zlepljene med sabo ali prilepljene na podlago. Značilnost biofilmskih struktur je tvorba matriksa iz zunajceličnih polimernih snovi (EPS), v katerega so vključene celice. Organizmi v biofilmih se fenotipsko razlikujejo od prosto plavajočih predstavnikov iste vrste. Izražajo se namreč geni, ki omogočajo tvorbo EPS, medcelično komunikacijo in prilagajanje na okolje. Večina mikroorganizmov na Zemlji je sposobna tvorbe biofilmov, vključno s patogeni. Bolezni, povezane z okužbami z biofilmi, so za razliko od akutnih okužb s prostimi organizmi kronične in veliko težje odpravljive. Eden izmed razlogov za to je odpornost proti antibiotikom, ki sicer delujejo proti prosto plavajočim organizmom iste vrste. Prenizke koncentracije antibiotikov lahko celo spodbudijo tvorbo biofilmov. Prav tako mikroorganizmi v biofilmih na več načinov zavirajo gostiteljski imunski sistem, kar še dodatno otežuje zdravljenje. Kljub temu da so biofilmi odgovorni za več kot 80 % okužb v telesu, so še vedno precej slabo razumljeni, strategije za njihovo odpravljanje pa pomanjkljive in premalo razvite. V nadaljevanju predstavljamo nekaj izmed najobetavnejših strategij za boj proti bakterijskim biofilmom.

Preprečevanje virulentnosti - zaznavanje celične gostote

Veliko bakterij sprošča v okolico virulentne dejavnike, ki ovirajo delovanje gostiteljskih celic. Razgradnja ali ustavitev sinteze takih dejavnikov vodi do izgube patogenosti in vodi do lažjega odpravljanja okužbe. Prednost takih metod je, da celic ne uničijo in posledično težje prihaja do razvoja odpornosti. Zaznavanje celične gostote – s tujko quorum sensing (QS) – je način bakterijske medcelične komunikacije. Pri gram negativnih bakterijah signalizacija poteka preko molekul iz skupine N-aciliranih homoserinskih laktonov (AHL). Za tvorbo AHL so potrebne AHL-sintaze, ki so zapisane na homologih gena lux I. Zapis za ta gen nosi bakterija Vibrio fischeri, pri kateri so prvič opazili proces zaznavanja celične gostote. LuxI se izraža konstitutivno, zato se AHL ves čas sintetizira in nalaga v okolico. Ob večanju gostote celic se povečuje tudi koncentracija AHL in ko doseže pražno vrednost, tvori kompleks z receptorjem LuxR. Taki kompleksi služijo kot transkripcijski faktorji za izražanje različnih genov, med drugim tistih, ki zapisujejo za virulentne dejavnike. Veliko raziskav kaže, da je taka komunikacija ključna za tvorbo biofilmov, zato je vmešavanje v te signalne poti uporabno pri njihovem odpravljanju. Molekule, ki zavirajo ta proces, so znane kot inhibitorji zaznavanja celične gostote. Obstaja veliko potencialno uporabnih inhibitorjev, med drugim tudi naravne komponente rastlin, na primer ekstrakti iz česna, ingverja in cimeta. Prav tako vpliva na mehanizem zaznavanja celične gostote tudi nekaj že obstoječih antibiotikov. Tak primer je makrolid azitromicin, ki je trenutno na kliničnih raziskavah za možnost zdravljenja okužb z bakterijo Pseudomonas aeruginosa pri pacientih s cistično fibrozo. Izkazalo se je, da azitromicin do neke mere zmanjša tvorbo biofilmov pri bolnikih s cistično fibrozo in izboljša delovanje dihal. Na žalost se ta učinek izniči pri daljših obdobjih uporabe, prav tako pa deluje samo v zgodnjih fazah tvorbe, ne pa tudi na zrelih biofilmih.

Preprečitev nastanka biofilma

Metode preventive se uporabljajo predvsem pri različnih vsadkih, ki jih pred vstavitvijo obdelajo z antibiotiki ali obsevajo z UV-svetlobo. Ključna je tudi površina vsadkov, ki je spremenjena tako, da je onemogočeno, da bi se bakterije prijele na površino. Na vsadke v telesu se pritrdijo proteini in različni polimeri – glikoproteinska plast. Glikoproteinska plast onemogoča sproščanje antibiotikov s površine vsadkov in predstavlja ligande za receptorje na membrani bakterijskih celic. Zgoraj opisane metode preventive so mogoče le na površinah, ki so lahko dostopne, na primer na površini umetnega kolka. Kako nastopati proti tvorbi biofilmov na območjih, ki jih ne moremo predhodno zaščititi? Strategije temeljijo na lastnostih, ki jih bakterije morajo imeti, da sploh lahko tvorijo biofilme. Ker so za nastanek biofilmov ključni izrastki na membrani celic, bi potrebovali metodo, s katero bi vplivali na signalno pot, ki omogoči tvorbo izrastkov na membrani. V matriksu (EPS) je prisotna tudi zunajcelična DNA, ki je ključna za stabilizacijo biofilma v začetnih fazah nastanka. Z razgradnjo zunajcelične DNA z DNazo I so preprečili tvorbo biofilma.

Razbitje ali razpršitev že obstoječega biofilma

Potem ko biofilm nastane, ga je zelo težko uničiti, saj so bakterije, ki sestavljajo biofilm, visoko odporne proti antibiotikom. Zgoraj opisane metode preventive so manj učinkovite, zato so razvili tri možne strategije, s katerimi bi agregat bakterij razbili. To je ravno obraten proces kot nastanek biofilmov, pri katerem zopet nastanejo planktonske bakterijske celice, ki so manj odporne na antibiotike. Te metode so poimenovali metode razbitja ali razpršitve biofilma (disruption of biofilm). Razpršitev biofilma je tudi naravno prisoten proces, ki je lahko posledica prisotnih virov ogljika v okolju. Nekatere bakterijske celice, ki jim v notranjosti biofilma primanjkuje hranil, le-tega zapustijo. Na ta način dobimo manj odporne planktonske bakterijske celice. Pri strategijah razbitja biofilma je ključno, da so skupaj z izbrano metodo prisotni še antibiotiki, da ubijemo posamezne, bolj dovzetne bakterijske celice. Tri predstavljene strategije so mehanski pristop (mehansko uničimo biofilm), uporaba encimov, ki razgradijo matriks, in zmanjšanje sposobnosti bakterij, da ostanejo v biofilmu pritrjene. Mehanski pristop razpršitve bakterijskega biofilma je dobro znan pri odstranitvi kariesa, saj dostopna površina omogoča mehanski pristop odstranitve. Mehanska metoda, ki bi se lahko uporabljala pri vsadkih, so ultrazvočni valovi, ki bi razpršili biofilme. Problem mehanskih metod je, da se lahko poškoduje tudi tkivo pacienta. Za nastanek in razpršitev biofilma so ključne signalne molekule c-di-GMP. Ko se koncentracija signalne molekule c-di-GMP v celici zmanjša, to sproži razpršitev biofilma. Koncentracija c-di-GMP v celici je odvisna od delovanja dveh encimov – digvanilat ciklaze, ki sintetizira c-di-GMP in fosfodiesteraza, ki razgradi signalno molekulo. Za zmanjšanje koncentracije c-di-GMP in posledično razpršitev biofilma je bilo pomembno odkritje proteina-BdcA, ki veže c-di-GMP in tako zmanjša koncentracijo prostega c-di-GMP.

Strategije pobijanja

Do sedaj najpogosteje uporabljena strategija uničevanja bakterijskih filmov temelji na uporabi antibiotikov, vendar so slednji zaradi problema povišane stopnje odpornosti na antibiotike v bakterijskih biofilmih manj učinkoviti. Najpogosteje se uporabljajo t. i. kombinirane terapije, pri katerih paciente zdravijo s kombinacijo različnih antibiotikov. Naslednji potencialni reagent za uničevanje bakterijskih biofilmov so galijevi( 3+) ioni. Zaradi sorodnosti z železovimi ioni enake valence ti vplivajo na redoks procese v metabolizmu bakterij. V eni izmed novejših študij so razvili posebne mikrofilme, zgrajene iz polielektrolitov, prepojenih z galijevim nitratom, ki omogočajo nadzorovano sproščanje galijevih ionov iz mikrofilma, ki je pritrjen na protibakterijski obliž. Ta metoda se zdi zelo obetavna za zdravljenje z bakterijskimi biofilmi okuženih ran. V boju proti bakterijskim biofilmom so učinkoviti tudi bakteriofagi, ključno vlogo pa ima njihov litični cikel, saj se konča s smrtjo bakterijske celice. Praviloma se uporabljajo kombinacije oz. zmesi različnih vrstno specifičnih bakteriofagov (angl. phage cocktails). Bakteriofagi izločajo tudi encime polisaharidne depolimeraze, ki razgrajujejo matriks biofilmov. Encimi tipa VAPGH ( angl. virion-associated peptidoglicane hydrolase) pa razgradijo bakterijsko celično steno in so tako bakteriofagu v pomoč pri okužbi gostiteljske celice. Obstaja še drug tip peptidoglikanskih hidrolaz, ki se imenuje endolizini. Ti destabilizirajo bakterijsko celično steno in olajšajo sprostitev na novo sintetiziranih virusov iz gostiteljske celice. Endolizine lahko uporabimo tudi kot samostojne protibakterijske reagente, kar ima v primerjavi z bakteriofagi nekatere prednosti. Večina bakteriofagov je namreč značilna za določeno vrsto bakterij, endolizini pa delujejo splošno. Poleg tega ni nevarnosti, da bi se ob okužbi z bakteriofagom na bakterije prenesli tudi virulentni dejavniki. Kljub tem prednostim pa še vedno obstajajo dvomi glede uporabe bakteriofagnih proteinov, saj tudi ti lahko tako kot sami bakteriofagi povzročijo močan imunski odziv.

Zaključek

Velika prednost strategij, ki temeljijo na preprečevanju patogenosti, je ta, da ne zavirajo rasti in s tem zmanjšajo selekcijski pritisk ter zmožnost za razvoj odpornosti na antibiotike. Metode preventive so manj učinkovite in se praviloma uporabljajo le za obdelavo medicinskih pripomočkov. Biofilme je mogoče razpršiti z mehanskimi metodami, vendar pa te lahko poškodujejo tkivo pacienta. Morda še najobetavnejše so strategije pobijanja, predvsem uporaba galijevih ionov in bakteriofagov. Ti dve metodi namreč ne temeljita na uporabi antibiotikov, s čimer se izognemo težavam zaradi povišane stopnje odpornosti na antibiotike, značilne za bakterijske biofilme. Vendar pa je potrebno poudariti, da so vse predstavljene metode šele v začetnih fazah raziskav in njihova uporaba še ni splošno razširjena. Vsekakor bo v prihodnosti razvijanje novih strategij za boj proti bakterijskim filmom igralo ključno vlogo, saj so okužbe z bakterijskimi biofilmi pogoste, njihovo zdravljenje pa je zaradi kompleksne narave bakterijskih biofilmov zelo zahtevno.

Viri

Gutiérrez, D., Rodríguez-Rubio, L., Martínez, B., Rodríguez, A. & García, P. Bacteriophages as Weapons Against Bacterial Biofilms in the Food Industry. Front. Microbiol. 7, 825 (2016).

Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat. Rev. Drug Discov. 2, 114–122 (2003).

Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M. & Høiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed? Nat. Rev. Drug Discov. 12, 791–808 (2013).

McDougald, D., Rice, S. A., Barraud, N., Steinberg, P. D. & Kjelleberg, S. Should we stay or should we go: mechanisms and ecological consequences for biofilm dispersal. Nat. Rev. Microbiol. 10, 39–50 (2011).

Lear G in Lewis GD. Microbial biofilms: current research and applications. Norfolk: Caister Academic, 2012. ISBN 978-1-904455-96-7.