Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

Uvod

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz reda Nidovirales. Vsi virusi družin reda Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA-virusi, obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo genoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA-virusi drugih redov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

Pomen poznavanja genoma

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonosnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

Mutacije virusov

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

Primerjava genomov med koronavirusi

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

Genom Koronavirusov

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč nukleotidov, kar ga uvršča med RNA-viruse z najdaljšim genomom. Na 5’-koncu je zaščiten s kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste strukture, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’-koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so protein S, ki sestavlja bodice (S - spike), protein M, sestavni del membrane (M - membrane),protein ovojnice E (E - envelope) in protein N (N - nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za proteine S, M, E, N. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le-teh. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice. Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne proteine, se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji sledi poli-A rep.

Bralni okvirji

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gama-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1ab (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA-psevdovozel, ki povzročata ribosomski premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo, dokler ne naleti na stop kodon rep 1a. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da se procesirata v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

Nestrukturni proteini

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov. Poznamo dva načina cepitve poliproteinov. V prvem primeru ena ali dve papainu podobni proteazi, ki se nahajata v nsp3, izcepita nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 - opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papainu podobne proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.

Nestrukturni proteini 2 - 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini. Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze. Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse (glej uvod). Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu. Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

Strukturni N protein

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

Življenjski cikel virusa v celici

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljskimi faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celično membrano in nato takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih veziklov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

Replikacija

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; kot prvo lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico, kot drugo pa lahko poteče diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov. Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdovozel in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozel na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija. Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko-transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona. Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

Viri

1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).