Proteini SSB pri arhejah

Uvod

SSB proteini (angl. single strand binding proteins) oziroma proteini, ki se vežejo na enojno vijačnico, igrajo pomembno vlogo pri podvojevanju, popravljanju in rekombinaciji DNA v vseh treh domenah. Gre za vezavo teh proteinov z namenom zavarovanja enovijačne DNA pred razgradnjo. Medtem ko to nalogo pri bakterijah opravljajo SSB proteini, so pri evkariontih prisotni RPA kompleksi (angl. replication protein A). Vezava SSB ali RPA na ssDNA (angl. single-stranded DNA) ni sekvenčno specifična, kar pomeni, da niso omejeni na določena vezavna mesta (lahko se vežejo kjerkoli na ssDNA). Vsi imajo OB zvitje oz. “OB fold” (angl. oligonucleotide/oligosaccharide binding domain), ki je bila najverjetneje prisotna pri skupnem predniku vseh treh domen življenja. OB zvitja so domene, na katere se veže ssDNA.

Delitev

V glavnem lahko RPA/SSB proteine pri arhejah razdelimo v štiri glavne skupine: RPA41, RPA32, proteine s samskim OB zvitjem in proteine z večimi OB zvitji. Najpomembnejša sta RPA41 in RPA32. RPA41 so evolucijsko precej podobni evkariontskim RPA1 in jih definira ena ali več OB zvitij ter značilen motiv cinkovega prsta. RPA32 so evolucijsko bolj podobni evkariontskim RPA2 in jih prepoznamo po eni ali dveh OB zvitjih ter motivom vijačnica-zavoj-vijačnica oziroma motivom HTH (angl. helix-turn-helix).

V arhejah so do zdaj našli tako RPA kot tudi SSB-ju podobne proteine. Zaradi podobnosti lahko eno skupino teh proteinov imenujemo kar “evriarhejski” RPA proteini (angl. euryarcheal) in jih najdemo pri deblu arhej “euryarchaeota”. V to deblo spadajo metanogene arheje, ki proizvajajo velike količine CH4, halobakterije, ki kljub imenu niso bakterije, pač pa arheje in lahko preživijo pri visokih koncentracijah soli ter termofile, ki živijo na temperaturah od 40 pa do 120 °C. Bakterijam bolj podobni proteini pa spadajo v deblo crenarchaeota in lahko govorimo o krenarhejskih SSB proteinih.

RPA proteini pri evriarhejah

Metanogene arheje

Metanogene arheje lahko ločimo na dva razreda (I in II). Metanogeni razreda I so obligatni anaerobi. Do danes so raziskali RPA proteine v treh različnih vrstah: Methanocaldococcus jannaschii, Methanothermobacter thermautotrophicus in Methanopyrus kandleri. Kljub temu, da ti proteini opravljajo enako nalogo, so si sekvenčno precej različni – manj kot 30% podobnost.

- Methanocaldococcus jannaschii vsebuje MthRPA oziroma MjaRPA proteine (645 aminokislinskih ostankov), ki spadajo med RPA41 proteine. MthRPA vsebuje 5 OB zvitij. Kljub temu, da ta vrsta vsebuje tudi zapis za RPA32 protein, tega še niso našli (hipotetično bi lahko ta s RPA41 tvoril dimer). So pa dokazali, da se lahko MthRPA veže na ssDNA s podobno afiniteto kot človeški RPA (močno).

- Methanopyrus kandleri vsebuje MkaRPA proteine (432 aminokislinskih ostankov). Tudi ti proteini spadajo med RPA41 proteine in imajo tri OB zvitja ter prav tako vsebujejo zapis za RPA32 protein.

Metanogeni razreda II so sicer bolj podobni halobakterijam, a vseeno proizvajajo velike količine metana, zato jih uvrščamo v drug razred. Zaenkrat je znana le ena vrsta z RPA proteini:

- Methanosarcina acetivorans ima zapis za tri homologe RPA (MacRPA1, MacRPA2 in MacRPA3). MacRPA1 (484 aminokislinskih ostankov) ima 4 OB zvitja, a nima cinkovega prsta, zato je bolj podoben RPA proteinom v halobakterijah. MacRPA2 in MacRPA3 pa sta si bistveno bolj podobna. Sta podobno velika (417 in 450 aminokislinskih ostankov) in spadata med RPA41 proteine. Zaradi podobnosti ju najdemo tudi v obliki dimerov.

Halobakterije

Druga glavna podvrsta arhej so halobakterije. Halobakterije so zelo sorodne Metanogenim arhejam (npr. M. acetivorans) ter raznim drugim evkariontskim organizmom, ki živijo v močno zasoljenih vodah, par takih primerov je v solnih jezerih in sončnih solinah.

- Haloferax volcanii vsebuje proteina Rpa1 in Rpa3 (zdaj naprej HvoRpa1 in HvoRpa3). Spadata med proteine RPA41 ter sta homologa MacRPA2 in MacRPA3. HvoRpa1 je sestavljen iz 427 aminokislinskih ostankov ter vsebuje le 3 OB zvitja. Največ se jih nahaja v C-končni regiji v obliki cinkovega prsta. S tem, da se nahaja v C-končni regiji, si je kar podoben s tipom DBD-C (DNA vezavna domena modela C) z integralskim C3H (cistein3histidin) cinkovim prstom. Pri evkariontih se DBD-C zvije okrog cinka, tako da se 3 α-vijačnice zvijejo v trojni heliks in ovijejo okrog cinka. HvoRpa3 je dolg samo 311 aminokislinskih ostankov ter vsebuje le 2 OB zvitji. Drugo zvitje je spet podobno tipu DBD-C z C3H cinkom. Oba proteina HvoRPA sta lahko skupaj prečiščena iz celic, ki ju prekomerno izražajo. H. volcanii se od ostalih arhej razlikuje po tem, da nima možnosti tvorbe RPA14 proteina (oz. RPA3) za tvorbo trimera, zato sklepajo, da obstaja le v obliki dimera (RPA41-RPA32). Pri evkariontih pa najdemo heterotrimerne komplekse, ki so sestavljeni iz RPA1, RPA2 in RPA3 (ali včasih RPA70, RPA32 in RPA14). Kompleksa HvoRpa1-HvoRpap1 in HvoRpa3-HvoRpap3 oz. prisotnost vsaj enega od njiju je nujno za delovanje celice. Pomanjkanje enega celici še omogoča preživetje, vendar je pomanjkanje dveh usodno. Če kateri od njiju manjka, povzroči da celica raste počasneje oz. da zamuja z rastjo. Pomanjkanje HvoRpa3-HvoRpap3 kompleksa je povzročilo povečanje občutljivosti arhej na mitomicin C v DNA in na UV svetlobo. Če pa manjka kompleks HvoRpa1-HvoRpap1, pa celica ne more popraviti vseh poškodb v sebi. Če je občutljiva na UV svetlobo, to potem vodi v tvorbo CPD-jev (ciklobutan pirimidinskih dimerov) in 6-4PP-jev (pirimidin 6-4-fotoproduktov). Ta dva kompleksa sta kritična za popravljanje DNA poškodb. Problemov, ki jih povzročijo produkti občutljivosti na UV svetlobo, še ne razumejo oz. še ne vedo kakšne so posledice. HvoRpa2 je ortolog MacRPA1 pri M. acetivorans in je dolg 483 aminokislinskih ostankov. Ima ohranjeno N-končno domeno, s štirimi OB zvitji vendar nimajo cinkovega prsta. Je esencialen za viabilnost celice in ne sme manjkat v genomu, saj to zopet vodi do zmanjšanja celične rasti. HvoRpa3-HvoRpap3 kompleks se lahko in vivo delno nadomesti z HvoRpa2. Če so ostranili OB1 in OB2, je to povzročilo malo zmanjšanje zmožnosti nadomeščanja, če pa so odstranili OB3 pa je prišlo do konkretnega zmanjšanja in je zaradi tega skorajda esencialen. Zanimiva stvar tega je, da kljub temu, da imajo ohranjeno N-končno regijo, nimajo cinkovega prsta, kar bi pričakovali, saj ga evkarionti imajo. - Halobacterium salinarum kodira homologe proteinov HvoRpa in HvoRpap imenovane HsaRfa proteini. So podobne sestave in velikosti, razen protein RPA32 HsaRfa7, ki je manjši za 160 aminokislinskih ostankov v osrednji regiji. Glavna razlika med temi homologi je, da med proteini HsaRfa ni nobene interakcije, kot je med HvoRpap, vsi pa imajo afiniteto za vezavo na ssDNA. Če odstranimo Rfa3 in Rfa8, celica postane bolj občutljiva na UV in IR svetlobo. Če odstranimo Rfa2 (homolog HvoRpa2), pa je to za celico usodno.

SSB proteini pri krenarhejah

Najbolje opredeljeni organizmi krenarhej spadajo v red Sulfulobales, ki vključuje tudi rod Sulfolobus. Veliko vrst iz tega rodu se uporablja za modelne organizme v biologiji arhej, med katerimi ima ključno vlogo S. solfataricus.

Sulfolobus solfataricus

SSB protein S. solfataricus (SsoSSB) je bil prvi biokemijsko opredeljen krenarhejski SSB protein in prav tako prvi, za katerega je bila določena tridimenzionalna struktura. Identificirali so ga na podlagi sposobnosti vezave na ssDNA, zaradi njegove pogostosti in preproste strukture, ki je podobna strukturi bakterijskega SSB proteina. 148 aminokislin dolga struktura vsebuje OB zvitje na N-končni domeni in fleksibilen C-končni rep bogat z glicinom, argininom in glutamatom. Oligomerno stanje SsoSSB je še zmeraj tema razprav, saj je predlagano tako monomerno kot tetramerno stanje proteina. Novejše raziskave kažejo, da se SsoSSB z visoko afiniteto ne veže zgolj na ssDNA temveč tudi RNA. Strukturna poravnava zvitja OB na N-koncu krenarhejskega proteina s SSB E. coli in evkariontskim RPA proteinom je razkrila večjo podobnost evkariontskemu zvitju DNA vezavne domene B (DBD-B), ki je odgovorno za vezavo ssDNA. Ta vezava je odvisna od nalaganja baz, ki vključuje tri ohranjene triptofanske aminokislinske ostanke in ne deluje specifično.

SsoSSB lahko destabilizira dvojno vijačnico DNA, kar je pogosto tudi pri ostalih SSB proteinih. Ta lastnost je dodatno ojačana, ko so v DNA prisotna neujemanja ene baze ali pa pri bolj zapletenih poškodbah DNA. To opažanje namiguje, da ima SsoSSB morda vlogo pri prepoznavanju in izbrisu napak DNA in vezavo proteinov, vpletenih v popravilo DNA. Kompleks SsoSSB proteinov in vanje vezane ssDNA interagira s številnimi proteini, med katerimi so XPB helikaza Rad50, topoizomeraza 1, RNA polimeraza in reverzna giraza. Slednji sta v neposredni interakciji s SsoSSB, za ostale pa obstaja možnost da interagirajo zgolj s ssDNA v kompleksu. Interakcija z RNA polimerazo spodbudi transkripcijo, interakcija z reverzno transkriptazo pa sproži korake vezave, cepitve in ligacije DNA.

Thermoproteales

Eden izmed kladov znotraj krenarhej je Thermoproteales. Večina do sedaj sekvenciranih genomov tega klada, namesto zapisa za arhejsko obliko RPA ali SSB proteinov, vsebuje zapis za poseben ssDNA vezavni protein – ThermoDBP. Opažanja nakazujejo, da je v Thermoproteales nekoč bil prisoten gen za SSB, ki ga je skozi evolucijo nadomestil gen za 196 aminokislin dolg ThermoDBP z neortologno zamenjavo gena. Takšna oblika ssDNA vezavnih proteinov je prisotna pri organizmu T. tenax (TteThermoDBP), kjer odraža močno vezavo na ssDNA, šibko vezavo na RNA in ne odraža vezave na dsDNA, kar je skladno s funkcijo SSB proteinov. Rešena struktura TteThermoDBP je razkrila kompaktno/jedrnato globularno domeno, ki jo sestavljajo štiri α-vijačnice in ena β-ploskev iz štirih antiparalelnih trakov. Prepoznana je bila tudi jamica za vezavo DNA, ki ima obliko idealno za interakcije z bazami kot tudi ogrodjem DNA.

Zraven ThermoDBP obstajata še dve skupini ThermoDBP sorodnih proteinov (ThermoDBP-RP), ki so jih identificirali na podlagi podobnosti njihovega aminokislinskega zaporedja z N-končno vezavno domeno TteThermoDBP. Obe skupini - ThermoDBP-RP1 in ThermoDBP-RP2 - najdemo v različnih organizmih krenarhejskih in evriarhejskih vrst. Modelni ThermoDBP-RP2 (iz A. pernix) se z visoko afiniteto veže na kratko (21 nt) hetero- ali homopirimidinsko ssDNA, ne veže pa se na homopurinsko ssDNA, na dsDNA ali na RNA. Modelni ThermoDBP-RP1 (iz P. furiosus) se na vse te kratke oblike DNA in RNA ne veže, kaže pa šibko vezavo na daljša zaporedja ssRNA. Strukturi obeh modelnih ThermoDBP-RP sta tetramerni. Kako je funkcija ThermoDBP-RP povezana s funkcijo ThermoDBP in ali je protein ključen za preživetje celic še ni znano.

Zaključek

V arhejah tako najdemo številne različice proteinov, ki se vežejo na enoverižno DNA (SSB ali RPA), ki imajo veliko raznolikost arhitekture domen in sestavnih podenot. V nekaterih arhejah so ti proteini bolj podobni bakterijskim SSB proteinom, v nekaterih evkariontskim RPA proteinom, ponekod pa so prisotne lastnosti obojih. Še zmeraj pa arhejski SSB/RPA proteini ostajajo dokaj neraziskano področje.

Viri

[1] Najwa Taib, Simonetta Gribaldo, Stuart Macneill. Single-Stranded DNA-Binding Proteins in the Archaea. Single Stranded DNA Binding Proteins, 2281, Springer US; Springer US, pp.23-47, 2021, Methods in Molecular Biology, 978-1-07-161290-3. [2] Thauer, Rudolf K., idr. „Methanogenic Archaea: Ecologically Relevant Differences in Energy Conservation“. Nature Reviews Microbiology, let. 6, št. 8, avgust 2008, str. 579–91. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/nrmicro1931. [3] Liu, Chunxiao, idr. „Genome-wide analysis of the C3H zinc finger family reveals its functions in salt stress responses of Pyrus betulaefolia“. PeerJ, let. 8, junij 2020, str. e9328. PubMed Central, https://doi.org/10.7717/peerj.9328. [4] Paytubi, Sonia, idr. „Displacement of the Canonical Single-Stranded DNA-Binding Protein in the Thermoproteales“. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, let. 109, št. 7, februar 2012, str. E398-405. PubMed, https://doi.org/10.1073/pnas.1113277108.