Biotehnološka uporaba RNAi

Uvod

Ko govorimo o biotehnološki uporabi RNAi se predvsem misli na njeno uporabnost v rastlinah. RNA interferenca se sedaj široko uporablja na tem področju, tako kot uporabno orodje za odkrivanje in validiranje funkcij genov, kot tudi hiter način inžinerske redukcije ekspresije izbranih genov. S posttranskripcijskim utišanjem genov za določene encime lahko odstranimo določene toksine ali pa povzročimo kopičenje nekega metabolita, katerega lahko nato izkoristimo v gospodarstvu ipd. Pri večini živali je zaenkrat ta potencial še vedno nedovoljno izkoriščen, predvsem zaradi kompliciranega načina transfekcije s plazmidi oz. direktne transfekcije s siRNA.

Spodaj vam predstavljamo nekaj uspešnih primerov biotehnološke uporabe RNAi:

Potencial RNAi v reduciranju alergenov

V industrializiranih državah alergije povzročajo velike prehranske težave tamkajšnjim prebivalcem. Kajti vsaka hrana, ki vsebuje beljakovine, ima potencial da izzove alergijske reakcije pri določeni skupini prebivalstva. Do danes je za več kot 300 rastlinskih beljakovin dokazano, da lahko povzročajo alergijsko reakcijo posredovano z imunoglobulinom E (IgE). To so sicer tudi najbolj pogoste alergijske reakcije pri ljudeh.

Čeprav stopnja razširjenosti alergij na hrano ni natančno znana, znanstveniki domnevajo da 1-2% odraslega prebivalstva in do 8% otrok trpi zaradi alergij na živila. Izogibanje hrani je v večini primerov edini primeren način zdravljenja, vendar se s tem zmanjša izbira prehrane in kakovost življenja alergične osebe. Rastlinski genski inženiring je obetavna možnost za odpravo ali zmanjšanje že znanih alergenov. To se lahko doseže z odstranitvijo IgE vezavnih domen na alergenih proteinih. Najbolj primeren način takšne izvedbe je gensko utišanje z RNAi, ki se je izkazalo kot najbolj uporabno, in vodi do skoraj 100% inhibicije endogenega transkripta. Četudi je obetaven, takšen biotehnološki pristop za rastline ni zelo razširjen, saj imajo alergeni lahko esencialen pomen za rastlinske celice in bi ob njihovi odsotnosti rastlina težko preživela.

Eden izmed takšnih uspešnih primerov je posttranskripcijsko utišanje genov, ki so odgovorni za produkcijo alergena Lyc e 3, kateri se nahaja v eni transgeni vrsti paradižnika. Njegovo delno aminokislinsko zaporedje je bilo rešeno z N-terminalnim sekvenciranjem. Po primerjanju z zaporedji že znanih proteinov se je izkazalo, da je Lyc e 3 prekurzor nespecifičnih proteinov, ki so odgovorni za prenos lipidov v membrani (angl. nsLTPs). V rastlinah, nsLTP-je kodirajo različne družine genov, ki se razlikujejo v aminokislinskem zaporedju, ekspresiji in predlagani celični funkciji. V odkrivanju alergene cDNA, so znanstveniki ugotovili da obstajata dve varianti, in sicer za dva različna proteina, LTPG1 in LTPG2. Ektopična ekspresija LTPG1 in LTPG2 v E. coli, kateri je sledil imunodetekcijski test, je potrdila njihovo reaktivnost z IgE. Nato so bile pridobili transgene rastline, ki so izražale dvojno-vijačne interferenčne RNA (dsRNAi) specifične za LTPG1 ali LTPG2 in testirane na prisotnost Lyc e 3. Učinkovito zmanjšanje ravni Lyc e 3 je bilo potrjeno z Western in Northern prenosom. Da bi se še bolj prepričali v verodostojnost svojih rezultatov, so preizkusili alergijski potencial novih rastlin z merjenjem histamina, ki ga izločajo človeški bazofilci, in sicer na ta način, da so jih stimulirali z vzorci obeh linij (transgene in kontrolne). Ugotovili so 10 do 100-kratno zmanjšano sproščanje histamina pri celicah, ki so bile stimulirane z novim transgenim produktom. Na ta način je bila potrjena funkcija dsRNAi v utišanju alergenih genov. Rezultati slednje raziskave odpirajo vrata množici novih poskusov, s katerimi bi se lahko reducirali alergeni v vseh ostalih rastlinah, predvsem v tistih, ki so najbolj razširjeni v vsakdanji prehrani ter na ta način omogočili tudi alergičnim osebam njihovo zaužitje in bolj kakovostno življenje.

Izkoriščanje semen bombaža v prehrani

Globalna proizvodnja bombaža potencialno lahko zagotovi beljakovinske zaloge za pol milijarde ljudi na leto, vendar je premalo izkoriščena, zaradi prisotnosti strupenega terpenoida gosipola v semenih bombaža. Zato je eliminacija le tega iz semen bombaža dolgoletni cilj genetikov in v ta namen so v zadnjih letih izvedli številne poskuse. No, kot najbolj uspešna metoda se je izkazala uporaba RNAi, s čimer se je produkcija gosipola v semenih drastično zmanjšala. Bistvo te metode je utišanje gena za sintezo δ-kadien sintaze, encima, ki je ključen za nastajanje gosipola. Znanstveniki so dokazali, da se na stabilen in deden način lahko raven gosipola v semenih bistveno zmanjša, kar so seveda potrdili encimski testi in molekulske analize transgenega zarodka, kot tudi zrelega semena. Kar je najbolj pomembno, nivo gosipola in podobnih terpenoidov se v listju in cvetnih delih ni zmanjšal, ter na ta način ohranil obrambno vlogo v zaščiti rastline pred različnimi insekti in boleznimi. Na ta način lahko premalo izkoriščeni agrokulturni pridelek, z biotehnološko uporabo RNAi, postane novi potencialni vir prehrane za več kot 100 milijonov ljudi.

Metabolni inženiring vrtnega maka (Papaver somniferum)

Rastlina Papaver somniferum, nam bolj znana pod imenom vrtni mak, sintetizira alkaloid –morfij, ki ji do neke mere zagotavlja zaščito pred škodljivci. Morfij se najpogosteje pridobiva z ekstrakcijo iz vrtnega maka, saj je njegova laboratorijska sinteza zelo zahtevna in draga. Danes se uporablja predvsem v klinične namene, in sicer kot analgetik. Ta se stereospecifično in z visoko afiniteto veže na μ-opioidne receptorje, ki se nahajajo v nevronih, in s tem zavre prevajanje živčnih dražljajev oz. dvigne prag zaznavanja bolečine. Vendar na žalost to učinkovino mnogi zlouporabljajo, tako da z acetiliranjem pridobivajo heroin.

Avstralski znanstveniki so pri študiju makovih celic podrobno raziskali metabolno pot nastajanja morfija, katerega začetni prekurzor je tirozin. Vse reakcije so encimsko katalizirane in medseboj regulirane glede na koncentracije intermediatov. Nato so se odločili, da s pomočjo RNAi posttranskripcijsko zavrejo sintezo encima kodeinon reduktaza, ki katalizira končno reakcijo pri nastanku morfija. Na ta način so želeli povzročiti akumuliranje sekundarnih metabolitov, ki imajo gospodarski potencial. Po utišanju gena tega encima, se je v celicah pričel akumulirati pomemben prekurzor S-retikulin in njegovi metilirani derivati. Iz S-retikulina v celicah maka sicer nastajajo psihoaktivne snovi, kot so morfij, kodein, oripavin in tebain, medtem ko sam S-retikulin nima psihoaktivnih učinkov. Določene raziskave kažejo, da S-retikulin stimulira rast las in je zaradi tega zanimiv za kozmetično industrijo, kajti ta vneto raziskuje učinkovine proti plešavosti. Kot substrat je pomemben tudi pri sintezi različnih spojin, ki delujejo protimalarijsko, saj so izrazito toksične za malarijskega prenašalca – plazmodija.

Metabolni inženiring navadnega tobaka (Nicotiana tabacum)

Podobno, kot pri maku, nikotin ščiti tobačno rastlino pred škodljivimi insekti. Toda poleg nikotina v tobaku nastaja še nezaželjen sekundarni metabolit - nornikotin, čigar nastanek katalizira encim nikotin N-demetilaza tekom zorenja rastline. Delež nornikotina v tobaku je <5%. Večji ko je njegov delež slabša je kakovost tobaka, bolj smrdi in bolj povzroča negativne učinke. Pri sušenju in tlenju tobaka pa poteka nitroziranje nornikotina in tako nastaja N-nitrozonornikotin. Ta je po mnenju nekaterih znanstvenikov kancerogena snov in potemtakem povzročitelj raka pri kadilcih, četudi poskusi na živalih tega ne potrjujejo tako zanesljivo. Kljub temu so ameriški znanstveniki prišli na idejo da s pomočjo RNAi utišajo izražanje gena za encim nikotin N-demetilaza. Na ta način so preprečili nastajanje nornikotina ter posledično N-nitrozonornikotina.

Uporaba RNAi v tobačni industriji lahko predstavlja dodano vrednost na trgu ter novo tržno nišo. Prodajali bi »varne« cigarete, ki ne vsebujejo nevarnega nornikotina in s katerimi bi kadilci potešili svojo potrebo. Toda danes točno vemo vzrok za nastanek pljučnega raka. Namreč tobačna rastlina iz prsti akumulira radioaktiven Po-210, katerega razpolovni čas traja 138 dni. Pri njegovem radioaktivnem razpadu nastajajo α-žarki, ki strahotno uničujejo naš organizem.

Biotehnološki potencial RNAi v prihodnosti

Čeprav je izjemni potencial RNAi, kot biotehnološko orodje vsekakor upravičen, pa se osnovna biologija teh procesov še vedno preučuje in relativne prednosti ter slabosti tega pristopa šele postajajo jasne. Trenutno, problemi z učinkovitostjo, stabilnostjo ter validnostjo omejujejo uporabo RNAi, tako za znanstvene, kot za komercialne namene. Vendar domnevamo, da bo hiter tempo novih odkritij kmalu pripeljal do množične biotehnološke uporabe RNAi.

Viri

• Quynh, L. et al. Design of tomato fruits with reduced allergenicity by dsRNAi-mediated inhibition of ns-LTP (Lyc e 3) expression. Plant Biotechnology Journal, 2006, letn. 4, str. 231–242

• Sunilkumar, G. et al. Engineering cottonseed for use in human nutrition by tissue-specific reduction of toxic gossypol. PNAS, 2006, letn. 103., štev. 48., str. 18054-18059

• Gavilano, L. et al. Genetic Engineering of Nicotiana tabacum for Reduced Nornicotine Content. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, letn. 54, str. 9071-9078

• Allen, R. et al. RNAi-mediated replacement of morphine with the nonnarcotic alkaloid reticuline in opium poppy. Nature Biotechnology, 2004, letn. 22, štev. 12, str. 1559-1566

• Small, I. RNAi for revealing and engineering plant gene functions. Current Opinion in Biotechnology, 2007, letn. 18, str. 148–153

• Wikipedia. RNA interference [online]. 2. 4. 2012 [citirano 2. 4. 2012]. http://en.wikipedia.org/wiki/RNA_interference