Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

Uvod

Celice, okužene s koronavirusom, vsebujejo 7 do 9 specifičnih virusnih mRNA s 3’ koterminalnimi konci. Vse mRNA molekule imajo na 5' koncih identična vodilna zaporedja, ki so dolga od 70 do 90 nukleotidov, na 3' koncu pa imajo poliA rep. Obstajata dva ključna elementa TRS (TRS; angl. transcriptional regulatory sequence), ki sta prisotna na 3′ koncu vodilnega zaporedja (TRS-L (angl. leader)) ter na 5′ koncu vsakega gena (TRS-B; angl. body) in delujeta kot cis-regulatorja transkripcije. Betakoronavirusi vsebujejo enako heptamerno zaporedje, 5’-UCUAAAC-3’, pri čemer ima SARS-CoV TRS 5’-ACGAAC-3’ kot osrednje zaporedje.

5' UTR in sekundarne strukture mRNA

5' neprevedena regija (UTR; angl. untranslated region) je regija na mRNA, ki se nahaja med mestom začetka transkripcije in enim nukleotidom pred začetnim kodonom (običajno je to AUG). Pomembna je pri nadaljnjih translacijskih in transkripcijskih mehanizmih. Včasih je (delno) prevedena v proteinske produkte, ki regulirajo translacijo glavnega kodirnega zaporedja mRNA, v veliko organizmih pa je 5' UTR popolnoma neprevedena in tvori kompleksne sekundarne strukture (dvojno vijačnico, lasne zanke, psevdovozle (PK; angl. pseudoknots) in tetrazanke (angl. tetraloops)), ki sodelujejo pri regulaciji translacije.

Nekatere izmed teh sekundarnih struktur so poimenovane stem-loops (SL). Zanke imajo večinoma obliko lasnih zank, se pa oblike lahko razlikujejo. Njihova vloga je največkrat povečanje strukturne stabilnosti mRNA. Pri virusih, natančneje koronavirusih, so pomembne zanke od SL1 do SL8, ki so bistvene za CoV podvajanje in sintezo virusne RNA. Sekundarne strukture v 5' končnih regijah so v veliki meri ohranjene, čeprav so nukleotidna zaporedja precej različna [1].

Zanke SL1, SL2 in SL3

SL1 ima dvodelno strukturo. Dve pirimidinski bazi delita SL1 zanko na zgornji in spodnji del. Zgornji del je pomemben za učinkovito virusno replikacijo. Spremembe, ki vplivajo na povezovanje baz na tem delu, lahko vplivajo na fenotipe virusa, in so lahko smrtonosne, medtem ko so spremembe na spodnjem delu virusi sposobni preživeti. Genomi, ki imajo spremembe v SL1, niso zmožni sintetizirati negativno smerne subgenomske RNA. Strukturna labilnost spodnje regije SL1 je pomembna za razmnoževanje virusa.

SL2 je najbolj ohranjena sekundarna struktura v 5' UTR. Ima 5 nukleotidov dolgo​ steblo, sestavljeno iz (C/U) UUG (U/C) in je najbolj ohranjeno zaporedje v 5' UTR. Zamenjava U48 s C ali A (sprememba U48C/U48A) je smrtonosna, virus, ki pa vsebuje spremembo U48G (zamenjava uracila z gvaninom na mestu 48) pa lahko preživi in raste ter izraža t.i. wild type fenotip. SL2 je torej iz strukturnega vidika zelo pomembna za preživetje virusov.

TRS oz. glavno TRS zaporedje nekaterih koronavirusov (npr. Sars-CoV, BCov) se nahaja v SL3 zanki. To zanko bi lahko našli tudi pri MHV virusu, vendar pri 37°C ni stabilna, zato je pri večini poskusov ne opazimo. TRS regija je enoverižna. Glavno TRS zaporedje ima ključno vlogo pri sintezi subgenomske RNA. Da lahko transkripcija poteka, je poleg drugih dejavnikov potrebna minimalna podobnost med TRS-L in TRS-B.

N protein se veže z veliko afiniteto in specifičnostjo na TRS-L. Vsebuje dve strukturno neodvisni RNA vezavni domeni: N-terminalna RNA vezavna domena (NTD; angl. N-terminal domain) in C-terminalna dimerizacijska domena (CTD; angl. C-terminal domain), ki sta povezani s Ser/Arg bogatim členom (angl. linker). Vezava proteina NTD na TRS je ključna za učinkovito sintezo subgenomske RNA.

Zanke SL4, SL5 in SL6

SL4 je sestavljena iz dveh delov, SL4A in SL4B. SL4B kot struktura ali kot zaporedje nima pomembnejše vloge pri virusni replikaciji, ampak sama celotna zanka deluje kot vmesnik (angl. spacer) in je pomembna za usmerjanje virusne subgenomske RNA.

SL5 zanka je pomembna pri replikaciji DI RNA (angl. defective interfering RNA) in se razteza od 5' UTR v zaporedje proteina nsp1. Ta protein pri SARS-CoV virusih zavira imunske funkcije gostiteljskega organizma in vpliva na translacijo gostiteljeve mRNA. SL5 ima obliko trifurkatne zanke, sestavljena je iz A, B in C delov in je od vseh zank najdaljša. Napake na SL5C zaradi zamenjave 4 nukleotidov rezultira v viabilnih rekombinantnih virusih z zgolj zmerno poškodovano virusno replikacijo.

SL6 zajema nukleotide 376-446 pri virusu MHV in kodira aminokislinske pozicije 56-79 za protein nsp1. Pri MHV SL6 ni ključnega pomena za virusno replikacijo, spremembe, ki vplivajo na SL6 so bolj pomembne zaradi njihovega vpliva na protein nsp1.

Zanke PRI SARS-COV-2

Pri SARS-CoV-2 opazimo zanke od SL1 do SL5, najdena pa je bila tudi manjša zanka med 4 in 5, ki so jo poimenovali SL4.5. Zanka SL1 ni ohranjena pri vseh sevih SARS-CoV-2 virusa. SL2 je primerljiva s SL3 pri BCoV virusu in je vključena v proces replikacije. Zanka (CUUGU) od SL2 je pomembna pri replikaciji MHV, kjer ima obliko U-obrata, medtem ko je pri SARS-CoV-2 v obliki tetra zanke.

SL3 zanka zajema TRS zaporedje. SL4 je razmeroma stabilna in dolga. Sama SL4 je pomembna pri sintezi subgenomskih RNA fragmentov. Na 3' delu 5' UTR je SL5 zanka, ki je bolj kompleksna, sestavljajo jo trije deli: SL5A, SL5B, SL5C. Pri Sars-CoV-2 se na SL5 nahaja nsp1 AUG začetni kodon.

3' UTR in sekundarne strukture mRNA

Koronavirusna 3' neprevedena regija (3' UTR) je sestavljena iz 300 do 500 nukleotidov in poliadenilacijskega repa oziroma poliA repa.

Različne študije so z uporabo algoritmov za zlaganje RNA, biokemičnih in funkcijskih študij poskušale preučiti strukturo in funkcijo 3' UTR. 3' UTR vsebujejo cis-delujoče regije, ki se zložijo v sekundarne strukture. Te prispevajo k večji stabilnosti ter sodelujejo pri tvorjenju intramolekularnih in intermolekularnih interakcij. Poleg tega pa ima 3' UTR tako kot tudi 5' UTR pomembno vlogo pri regulaciji RNA replikacije in transkripcije.

Zanka BSL

Proti 3' koncu, tik za stop kodonom N gena, se nahaja sekundarna struktura stebelne zanke (BSL; ang. bulged stem loop), ki je pri MHV dolga 68 nukleotidov. BSL ima ključno vlogo pri replikaciji virusne RNA. Štirje kovariantni bazni pari v tej zanki pa so ključni za funkcionalnost te sekundarne strukture.

Psevdovozel

Lasna zanka se nahaja od BSL proti 3’ koncu in tvori psevdovozel (PK; angl. pseudoknot - sekundarna struktura z vsaj dvema zankama, kjer se polovica ene zanke vstavi med polovici druge zanke) z BSL. Ta je pri različnih vrstah koronavirusov ohranjena po lokaciji in obliki. Po zaporedju nukleotidov pa se nekoliko razlikuje, kar nakazuje, da bi lahko deloval kot regulatorni kontrolni element.

Za trojni spoj alfa vijačnic S3 je bilo dokazano, da ta pripomore k stabilizaciji strukture psevdovozla. Konformacija psevdovozla je manj stabilna od konformacije dvojne lasne zanke. S3 pa naj bi imela tudi pomembno vlogo pri replikaciji.

Prekrivanje BSL in PK v 5 nukleotidih je razlog, da se te dve strukturi ne moreta hkrati popolnoma zložiti. To nakazuje, da vsak element tvori nadomestne konformacije in v določeni fazi RNA delujeta kot molekularno stikalo sinteze RNA.

Zanka HVR

Na primeru MHV je bilo ugotovljeno, da se navzdol od PK nahaja tako imenovana “multi-branch stem loop”. Gre za dolgo hipervariabilno regijo (HVR; angl. hypervariable region), ki v svoji strukturi vsebuje oligonukleotidno zaporedje 5'-GGAAGAGC-3' in je dobro ohranjeno med različnimi vrstami koronavirusov. V strukturi na 3' koncu najdemo tudi trojni spoj alfa vijačnic, ki jih označujemo s S3 in S4 in obdajata lasno zanko (S2-L2).

Zanka L1

Zanka 1 (L1; angl. loop-1) se nahaja med BSL in PK. Prihaja do interakcije med L1 in 3' koncem genoma s proteinskim kompleksom (nsp7, nsp8 in nsp9). To povzroči konformacijske spremembe v 3' koncu RNA, kar omogoči tvorbo psevdovozla, ki omogoča vezavo od RNA odvisne RNA-polimeraze (nsp12), helikaze in proteinov nsp14, nsp10. To pa omogoči iniciacijo sinteze negativne verige RNA.

Pri alfakoronavirusih je PK ohranjen, lahko pa je v njihovi strukturi odsotna BSL. Pri gamakoronavirusih je PK prisoten, ni pa znano, kakšna je njegova funkcija. Do tesnega prekrivanja med BSL in PK prihaja samo pri betakoronavirusih. Sekundarna struktura je pri betakoronavirusih ohranjena, čeprav se nukleotidno zaporedje med različnimi betakoronavirusi razlikuje.

Interakcije med 5’ in 3’ koncema

Interakcije med 5' in 3' koncema v pozitivno smernih RNA virusih preko RNA-RNA, RNA-protein ali protein-protein interakcij vodijo do cirkulacije genoma s pomočjo N proteina, ki tvori most med 5' in 3' koncema. Lahko pomaga tudi poli a vezavni protein (PABP; angl. poly A binding protein), vezan na 3' poli A rep, preko interakcije z eIF-4G, komponente eIF-4F kapa vezavnega proteina, ki se veže na mRNA kapo na 5’ koncu med translacijo.

Vezava N proteina s strukturo S3 in 15 nukleotidov dolgim poli A repom je dovolj za iniciacijo sinteze negativno smerne verige. Spremembe v 5' in 3' končnih zaporedjih zmanjšajo vezavno afiniteto med N proteinom in obema koncema, kar vpliva na učinkovitost iniciacije sinteze negativno smerne verige.

Literatura

• Y. Dong, J. L. Leibowitz: The Structure and Functions of Coronavirus Genomic 3’ and 5’ Ends. Virus Res. 2015, 206, 120–133.
• L. I. Sola, F. Almazán, S. Zúñiga, L. Enjuanes: Continuous and Discontinuous RNA Synthesis in Coronaviruses. Annu. Rev. Virol. 2015, 2, 265–288.
• K. Narayanan, C. Huang, K. Lokugamage, W. Kamitani, T. Ikegami, C.-T. K. Tseng, S. Makino: Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Nsp1 Suppresses Host Gene Expression, Including That of Type I Interferon, in Infected Cells. J. Virol. 2008, 82, 4471–4479.
• Z. Miao, A. Tidu, G. Eriani, F. Martin: Secondary Structure of the SARS-CoV-2 5’-UTR. RNA Biol. 2021, 18, 447–456.
• C. ‐Y. Lo, T. ‐L. Tsai, C. ‐N. Lin, C. ‐H. Lin, H.‐Y. Wu: Interaction of coronavirus nucleocapsid protein with the 5′‐ and 3′‐ends of the coronavirus genome is involved in genome circularization and negative‐strand RNA synthesis. FEBS J. 2019, 286, 3222-3239