Pregled in prihodnost postopkov za pripravo iPSC

Prve inducirane pluripotentne celice (krajše iPSC) so bile proizvedene leta 2006 in sicer iz mišjih celic, leto kasneje pa še iz človeških. Zasluge za to revolucionarno odkritje si delite dve skupini raziskovalcev, prva pod vodstvom Shinya Yamanaka iz japonske in druga skupina Jamesa Thompsona iz ZDA. Ko je novica o odkritju obšla svet, je to vzbudilo mnoga pričakovanja o uporabi teh celic na različnih področjih in povzročilo veliko zanimanje znanstvenikov širom po svetu. Z možnostjo produkcije iPSC je končno postalo mogoče pridobiti matične celice, ki so izredno pomembne pri raziskavah, brez kontroverzne uporabe embrijev. Te celice so tako predstavljale priložnost za razvoj: modelov človeških bolezni in vitro, orodij za opazovanje vpliva raznih substanc na človeško tkivo in seveda virov različnih somatskih celic pri zdravljenju bolezni. Zato je področje pridobivanja iPSC v zadnjih nekaj letih doživelo izjemen razcvet in še vedno predstavlja zelo obetavno smer za nadaljnje raziskave.

Prve metode priprave iPSCs

Prvi dve metodi produkcije pluripotentnih celic iz diferenciranih, ki sta jih odkrila Yamanaka in Thomson, sta temeljili na uporabi štirih reprogramacijskih faktorjev (krajše RF). Japonski raziskovalci so uporabili Oct4, Sox2, Klf4 in c-Myc, medtem ko so američani namesto zadnjih dveh uporabili Lin28 in Nanog. Oboji so nato omenjene faktorje v genom vnesli s pomočjo virusne transdukcije, kar je omogočilo njihovo izražanje in tako postopno reprogramacijo celice. Obe metodi sta bili uspešni tako na mišjih, kot tudi človeških celicah. Vendar je kmalu postalo jasno, da ti dve metodi nista dovolj učinkoviti za uresničitev vseh potencialov IPSC. Največji problem je predstavljala velika količina naključne DNA, ki se je zaradi uporabe virusov, vgradila v genom skupaj z RF, kar pa je predstavljalo veliko tveganje nastanka neželenih mutacij.Za generacijo stabilnih celičnih kultur iPSC, je potrebna veliko večja učinkovitost, kot sta jo lahko zagotovili omenjeni metodi, saj so z njima dobili le približno 0,1% uporabnih pluripotentnih celic. V primerjavi z embrionalnimi zarodnimi celicami (ESC), so bile te celice zelo slabe kvalitete, kar je bil še en razlog za razvoj naprednejših metod.

Razvijanje učinkovitejših metod

Alternative uporabi c-Myc

Velik problem pri pripravi matičnih celic predstavlja njihova tumorogenost. Ta problem je izrazit predvsem pri zarodnih matičnih celicah, prisoten pa je tudi pri pripravi iPSC. Eden od reprogramacijskih faktorjev, c-Myc, ki se uporabljajo za reprogramiranje v iPSC je močan onkogen. Zato si raziskovalci prizadevajo, da bi zanj odkrili učinkovit zamenjavo, pri čemer se pogosto porajajo problemi nizke učinkovitosti in tehnično zahtevne izvedbe priprave. V zadnjih letih so bile odkrite številne tehnike kako se izogniti uporabi c-Myc, ki vključujejo različne pristope, bodisi z uporabo drugih transkripcijskih faktorjev ali nekodirajoče RNA. Prvi pristop je da c-Myc preprosto nadomestimo z drugim reprogramacijskim faktorjev, kakršna sta Gli1 in L-Myc. Gli1 je transkripcijski faktor, ki se izraža zgolj v enoceličnem obdobju embrionalnega razvoja, L-Myc pa spada v isto družino kot c-Myc. Kot nadomestilo za c-Myc se lahko uporabi tudi Parp1(poli(ADP-riboza) polimeraza 1), katere delovanje je močno povezano c-Myc. Nadaljnje, izkazalo se je da lahko RF Tbx3 ne le nadomesti c-Myc, ampak je celo učinkovitejši. Drugi pristop je da aktiviramo Wnt signalizacijo, gre za signalno omrežje, ki sodeluje pri prenosu signalov iz plazmaleme v notranjost celice. Lahko se uporabi kombinacija inhibicije p53 in povečane ekspresije UTI1. UTI1 je za embrionalne matične celice specifičen transkripcijski faktor. Poleg tega lahko ti dve metodi povečata nastajanje kolonij iPSC. Nastanek iPSC pospešuje tudi utišanje p53/p21 poti, vendar lahko to vodi do nestabilnosti genoma. Z nekaterimi novimi metodami lahko nadomestimo poleg c-Myc tudi druge transkripcijske faktorje. Esrrb(z estrogenom povezan receptor β) lahko nadomesti c-Myc in Klf4, domneva se da lahko skupaj z Nanog sodeluje pri aktivaciji Oct4. Skupini znanstvenikov je uspelo reprogramirati mišje fibroblaste zgolj z Oct4 in aktivacijo sonic hedgehog signalizacije. Z uporabo Jhdm1b(člana družine Jumonji histon 3 lizin 36 demetilaz) se lahko nadomesti celo tri transkripcijske faktorje(Sox2, Klf4 in c-Myc) preko aktivacije miR-302/367. Podobno lahko BMP( kostni morfogeni proteini) samo z Oct4 sprožijo reprogramiranje mišjih fibroblastov z aktivacijo faze MET(Mesenchymal-to-Epithelial Transition), ki je kritična v procesu reprogramiranja.

Alternative uporabi Oct4

Transkripcijski faktor Oct4 igra osrednjo vlogo pri reprogramiranju celic v iPSC, vendar se ga lahko zamenja z uporabo drugačnih pristopov. Lahko ga nadomesti uporaba Nr5a2, sicer podobnega jedrnega receptorja, skupaj z ekspresijo Sox2 in Klf4. Prav tako lahko vsiljena ekspresija E-kadherina nadomesti Oct4 v mišjih fibroblastih. Namesto Oct4 se lahko uporabi DNA hidroksilaza Tet1, ki preko demetilacije reaktivira Oct4.

Zmanjševanje neželenih virusnih vgraditev v genom

V grobem metode za pripravo iPSC razdelimo na tiste pri katerih v celico vnašamo želene komponente z virusi in tiste brez uporabe virusov, najpogosteje s transfekcijo. Pri virusnih metodah je najprej prišlo do izboljšanja omenjenih pomanjkljivosti z uporabo lentivirusnih konstruktov z policistronskim izražanjem, kar pomeni, da se geni za vse RF izražajo kot en sam transkript. To je močno zmanjšalo število neželene DNA, vrinjene v genom tarčne celice. Nadaljnji napredek na tem področju je prinesla uporaba raznih izrezovalnih sistemov, kot je Cre/LoxP, ki lahko iz genoma odstranijo integrirano DNA (transgene). Tako dobljene celice so veliko bolj podobne ESC in imajo izboljšan diferenciacijski potencial. IPSC, ki niso vsebovale niti enega integriranega transgena so bile najprej pridobljene z ti. PiggyBac transpozicijo, kasneje z začasno transfekcijo plazmidov, episomalnimi vektorji iz Epstein-Barr virusa in neintegrirajočimi virusi kot sta Raav In Sendai virus. Veliko je obetala tudi tudi uporaba sintetične modificirane mRNA, miRNA in rekombinantnih proteinov za pripravo iPSC. Vse te metode odlikuje odsotnost transgenov, vendar pa imajo, z izjemo piggyBac in metode z mRNA, v primerjavi z integracijskimi virusnimi zelo nizko učinkovitost.

Drugi dejavniki, ki vplivajo na učinkovitost metod pridobivanja iPSCs

Pri produkciji čim bolj kvalitetnih iPSC pa se je izkazalo za izredno pomembno tudi količinsko razmerje med posameznimi RF. Mnoge študije so pokazale, da je še posebej veliko pozornost treba posvetiti intenziteti izražanja Oct4 in Klf4. . Kot koristen dodatek se je izkazal tudi vitamin C, ki je poveča učinkovitost reprogramiranja in izboljša kvaliteto. Pomembno vlogo pri procesu reprogramiranja ima stanje kromatina, vendar sami mehanizmi, ki so v ozadju reprogramiranja še vedno niso razjasnjeni. Kritično točko v aktivaciji bi lahko predstavljala metilacija evkromatina.

Drugačni pristopi k pripravi iPSC

Popolnoma drugačen je pristop, pri katerem lahko za reprogramiranje uporabimo nekodirajočo RNA (ncRNA). Uporabni sta predvsem mikroRNA in dolge intergenske RNA(oz. lincRNA). Rot regulator reprogramiranja je med lincRNA znana lincRNA-RoR, ki služi pri reprogramiranje človeških somatskih celic v pluripotentne. Veliko pa obetajo tudi miRNA: miR-200c, skupina miR-302/367 in člani družine miR-369. Kot nova oblika virusnega načina vnosa informacije v celico je bil odkrit rAAV(rekombinanten adeno-associate virus), ki se je izkazal kot zelo učinkovit pri vnosu transgene DNA v celico. S tem poskrbimo za konstantno izražanje transkripcijskih faktorjev potrebnih za reprogramiranje. Katera od številnih na novo odkritih tehnik reprogramiranja do iPSC se bo izkazala za najučinkovitejšo, bodo pokazale nadaljnje raziskave in predvsem njihova uporaba v praksi.

Direktno reprogramiranje v druge celične tipe (transdiferenciacija)

Matične celice pogosto služijo temu da lahko iz njih razvijemo želeno tkivo zato je smiselno razmišljanje, da bi preskočili stanje pluripotentnosti in celice reprogramirali direktno v želeno vrsto celic. Metode pri dosegu tako imenovane transdiferenciacije so sila podobne metodam uporabljenim pri vzgoji iPSC. Uporabljeni so tudi isti štirje transkripcijski faktorji kot pri iPSC. Znanstvenikom je uspela transdiferenciacija mišjih fibroblastov v matične živčne celice, zgolj z kontrolirano uporabo štirih faktorjev. Za te celice je bilo ugotovljeno da niso bile v vmesnji fazi pluripotentnosti, kakor so znansveni sprva domnevali. Prav tako je možno, zgolj z dolgotrajno ekspresijo Oct4, pretvoriti fibroblast v hemopoetične matične celice. Ena od poglavitnih prednosti transdiferenciacije je da dobimo po reprogramiranju zgolj eno vrsto celic, medtem, ko pri vzgoji iz iPSC lahko nastane več celičnih tipov.

Viri

Samer MI Hussein in Andras A Nagy, Progress made in the reprograming field: new factors, new strategies and a new outlook, Current Options in Genetics & Development, 2012, št. 22, str. 435-443

Janghwan Kim in sod., Direct reprogramming of mouse fibroblast to neural progenitors, PNAS, 2011, let. 108, št. 19, str. 7838-7843

Shih-Hwa Chiou in sod., Poly(ADP-ribose) polymerase 1 regulates nuclear reprograming and promotes iPSC generation without c-Myc, JEM, 2012, izd. 210, št. 1, str. 85-98

Yawei Gao in sod., REplacement of Oct4 by Tet1 during iPSC Induction Reveals an Important Role of DNA Methylation and Hydroxymethylation in Reprograming, Cell Stem Cell, 2011, št. 8, str. 96-105

Yamanaka, Induced Pluripotent Cells: Past, Present, and Future; Cell Stem Cell, 2012, št. 8, str. 678-684