Mejozna rekombinacija

Homologna rekombinacija med 1. mejotsko delitvijo ali z drugimi besedami mejozna rekombinacija omogoča nastanek genetsko raznolikih gamet. Pri tem procesu se izmenjajo deli DNA med dvema DNA vijačnicama, ki imata nekatere dele zaporedja zelo podobne. Genetsko raznolikost gamet zagotavljata prekrižanje homolognih kromosomov in genska pretvorba, ki sta rezultat mejozne rekombinacije. V osnovi je homologna rekombinacija eden od načinov popravljanja dvojnih prelomov DNA. Kot osnova za popravilo preloma dvojne vijačnice ene kromatide kromosoma služi veriga kromatide homolognega kromosoma.

Modeli homologne rekombinacije

Pri sesalcih so za uspešno mejotsko rekombinacijo poleg navedenih proteinov in njihovih analogov potrebni še mnogi, v večji meri še neodkriti proteini. Navedeni so splošni postopki v evkariontskih celicah. Na eni od homolognih verig DNA se pojavijo prekinitve. Nastane jih toliko, da na paru homolognih kromatid vsaj enkrat pride do izmenjave dednega materiala. Mesto popolnega preloma verige in posledično mesto, kjer bo prišlo do mejozne rekombinacije in izmenjave med homolognima kromatidama se imenuje Kiazma. Za njihovo tvorbo je potreben encim SPO11, ki s kovalentno vezavo na DNA verigo povzroči prelom (način delovanja je podoben DNA topoizomerazi). Do prelomov in posledično do izmenjave dednega materiala prihaja v ‘hot spot‘ regijah, okoli 1000 do 2000 nukleotidov dolgi kosi DNA in predvsem na CpG bogatih regijah promotorjev genov. Z endonukleazno cepitvijo encima MRN in CtIP odstranita SPO11 z mest dvojnega preloma. Takoj za tem sledi resekcija koncev v smeri 5’-3’, ki jo med drugimi opravlja EXO1 ali DNA2 s helikazo. Pri resekciji se se izreže okoli 100 nukleotidov. Ker jo opravlja več različnih proteinov, ki delujejo tako na 5’ kot na 3’ koncu, je ta korak odločilen za pravilno napredovanje in časovno umestitev podvojitve dednega materiala. Resekcija je v G1 fazi zelo počasna. Očitno je, da povečana koncentracija CDK1 pozitivno vpliva na hitrost resekcije, ta pa je nizka v G1 fazi in se z napredovanjem skozi celični cikel, predvsem med M in G2 fazo močno poveča. Če je na prostem koncu prisoten protein RPA je to dovolj, da se s pomočjo drugih proteinov (Rad52) protein Rad51 in BRCA2 vežeta na zdaj enojno (ssDNA) verigo in tvorita nukleoproteinski filament na prosti 3’ konec. Ta s proteinom ovit in raztegnjen del ssDNA je imenovan invazivni. Podobno vlogo ima tudi protein Dcm1. Vloga tega filamenta je, da aktivno išče homologno verigo DNA, nato pride do izpodrinjanja konca iz originalne verige DNA. Svoj par najde na homologni verigi, ki se je na tem mestu razvila, ne pa tudi razklenila in tvorila odprto zanko. Invazivni 3’ konec utrjen z Dcm1 zdaj vdre v odprto zanko sosednje verige in se poveže s homologno donorsko sekvenco. Tvori se D-zanka in odmaknjena polovica homologne verige se poveže s homolognim zaporedjem preostalega neresektiranega konca. Tukaj se mehanizem nadaljnje homologne rekombinacije razdeli na dva predlagana modela, DSBR (angl. double strand break repair), poznan tudi kot model dveh Hollidayevih križišč in SDSA (angl. synthesis dependant strand annealing). Pri DSBR sta možni dve rešitvi nastalega kompleksa, ena vključuje prekrivanje in statistično veliko bolj verjetna, pri drugi pa do prekrižanja ne pride. SDSA model ne dopušča prekrivanja in se med mejotsko delitvijo lahko zgodi med 4 in 15-krat pogosteje kot DSBR. Modela razložita pojav pretvorbe genov (angl. gene conversion, GC). SSA je sicer model popravljanja DBS med mejozo, ampak pri njem do GC ne pride. Četrti poseben način popravljanja DSB je mehanizem BIR.

SSA (single strand annealing)

Je edini od popravljalnih mehanizmov med homologno rekombinacijo (HR), za katerega formacija D-zanke ni potrebna. Temelji na kratkih ponovitvah zaporedja pred in po prelomu verige. Mehanizem se sicer dogaja na DSB med HR, ampak je neodvisen od Rad51 in do invazije krakov ne pride, ker mehanizem ni odvisen od homologne kromatide. Resekcija z Rad endonuklazami izpostavi homologna zaporedja na obeh krakih, ki lahko tvorita DNA vijačnico, pri tem se ves dedni material med zaporedjema nepovratno izgubi.

DSBR (double strand break repair)

D-zanka se podaljša in ssDNA nasproti invazivnemu koncu (resektirani 3' konec) se poveže z homolognim delom razvite zanke. Invazivni konec, ki ga polimeraze zdaj podaljšajo ob matrični verigi se zlepi s tem 3+ koncem in tvori intermediat z dvema Hollidayevima križiščema (HK). HK resolvaze bodo tako križišče presekale na dva načina. Pri prvem bo prišlo do horizontalne razrešitve križišč in do prekrižanja ne pride, pri drugem resolvaze delujejo vertikalno in pride do popolne obrnitve delčkov Verig. Varnostni mehanizmi poskrbijo, da v bližini prekrižanja DNA nekaj časa do ponovnega prekrižanja ne pride

SDSA (synthesis dependant strand anneling)

Po tvorbi D-zanke, DNA polδ ali polε sintetizirata na invazivnem 3’ koncu podaljšek. Novo sintetiziran konec homologen sosednji DNA verigi se loči od D-zanke in najde resektirani konce svoje originalne verige. Zdaj je del resektiranega dednega materiala enak homologni verigi in popravljalni mehanizmi poskrbijo,da se ta nov dedni material ujema z starim, ali pa starega prilagodijo temu. Obstajajo redke izjeme, kjer pride do migracije D-zanke in zaradi tega lahko potencialno še vedno pride do formacije Hollidayevega intermediata in posledično prekrižanja.

BIR (break repair mechanism)

Poteka, če med podvajanjem pride do hude poškodbe, kjer se kos kromosoma odlomi. Ker dedni material na drugi strani DBS manjka se resekcija zgodi samo na prisotni polovici in invazivni konec ob vdoru v D-zanko tvori enosmerne replikacijske vilice, ki prepišejo ves manjkajoči del DNA. Posledica je velika izguba raznolikega dednega materiala, ampak mejoza se lahko zaključi. BIR mehanizem se dogaja šele v S fazi celičnega cikla in je izredno mutagen.

Genska pretvorba

V drugi mejotski delitvi nastanejo gamete, ki so haploidne. Če ima diploidna celica, iz katere gamete nastanejo, ob vstopu v proces mejoze nek določen gen prisoten v dveh alelih (npr. alel A na materinem kromosomu in alel a na očetovem kromosomu), po Mendlovem zakonu segregacije ali izločitve pričakujemo, da bo po ločitvi kromatid v dveh nastalih gametah prisoten alel A, v drugih dveh pa alel a. Raziskave na kvasovki pokažejo, da temu ni vedno tako. Lahko se zgodi, da nastanejo 4 produkti mejoze, pri kvasovki imenovani tetrade, v katerih je v treh prisoten alel A, alel a pa samo v eni.
Ta pojav je posledica procesa imenovanega genska pretvorba, pri katerem se genetska informacija enosmerno prenese iz donorskega zaporedja na homologno akceptorsko zaporedje. Genska pretvorba v splošnem lahko poteče tudi med podobnimi zaporedji na sestrskih kromatidah ali na isti kromatidi med kopijami določenega gena.
Med mejozo se genska pretvorba zgodi med kromatidama homolognih kromosomov. Situacije, ki lahko vodijo v gensko pretvorbo, nastanejo pri produktih zgoraj opisanih poti SDSA in DSBR oz. z drugimi besedami, genska pretvorba je posledica poti SDSA in DSBR. V bližini mesta, kjer se je prej nahajal dvojni prelom verige DNA, sta sedaj v dvojno vijačnico vezani zaporedji, ki nista po celi dolžini identični, ampak sta na nekaterih mestih samo homologni. Tako zaporedje, pri katerem ujemanje baz ni popolno, imenujemo heterodupleks. Po poti SDSA se ob mestu, kjer se je nahajal prelom, pojavi en heterodupleks, po poti DSBR pa dva, vsak na svoji verigi in sicer na nasprotnih straneh glede na mesto preloma dvojne vijačnice. Kjer nastane heterodupleks, lahko pride do popravljanja neujemanja na dva načina. Po prvem načinu lahko popravljanje poteče na drugi verigi, tako da se bo le-ta popolnoma ujemala s prvo verigo, ki služi kot osnova za popravljanje. Pri drugem načinu pa druga veriga služi kot osnova za popravljanje prve. V primeru, ko se na področju heterodupleksa nahajata različici nekega gena, npr. alel A, ki izvira iz verige, ki je bila prelomljena, in alel a, ki izvira iz neprelomljene verige, lahko po prvem načinu kot osnova za popravljanje služi veriga, na kateri je prisoten alel A. Ta način vodi v stanje, kjer je razmerje med aleli A in a na skupno 4 kromatidah 2:2, kar pomeni, da delitev alelov med tetrade ustreza Mendlovemu zakonu. Če za osnovo popravljanja neujemanja služi druga veriga, torej v tem primeru alel a iz neprelomljene verige, bo končno razmerje alelov A in a na 4 kromatidah 1:3, kar pomeni, da je prišlo do genske pretvorbe.
Do le-te med potjo DSBR lahko pride tudi ob sintezi komplementarne verige enovijačni DNA, ki je prisotna, ko nastane D-zanka. Tudi pri poti SDSA pride do genske pretvorbe ne samo s popravilom heterodupleksa, ampak tudi s sintezo komplementarne verige novonastali enovijačni verigi. Raziskave kljub tem dodatnim možnostim kažejo, da je večina genskih pretvorb posledica opisanega popravljanja neujemanja heterodupleksov. Možno pa je, da do popravljanja neujemanja sploh ne pride. V tem primeru pride do post-mejotske ločitve med mitozo, na koncu katere dobimo razmerje kromatid, ki vsebujejo alel A proti razmerju teh, ki vsebujejo alel a 3:5. Po podvojitvi DNA med mitozo ni več prisotnih heterodupleksov. Do post-mejotske ločitve pri kvasovki pride v skoraj 10% dogodkov mejozne rekombinacije.

Biased gene conversion

Izkaže se, da so nekateri aleli bolj podvrženi genski pretvorbi kot drugi, kar angl. imenujemo biased gene conversion. Na mestih, kjer so v heterodupleksih prisotni pari A:C in G:T, poteče pretvorba nepravilnega parjenja baz v G:C in ne v A:T. Posledica tega pojava je, da na mestih, kjer genska pretvorba poteče, posledično nastanejo regije, ki so bogate s C:G pari.

Viri

Tropp, B. E. Principles of Molecular Biology, 1. izdaja. Burlington: Jones & Bartlett Learning, 2014.

Merker, J., Dominska, M., Petes, T. Patterns of heteroduplex formation associated with the initiation of meiotic recombination in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 2003, 165, str. 47-63.

Haber, J., Ira, G., Malkova, A., et al. Repairing a double-strand chromosome break by homologous recombination: revisiting Robin Holliday's model. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 2004, 359, str. 79-86.

Mehta, A., & Haber, J. E. (2014). Sources of DNA Double-Strand Breaks and Models of Recombinational DNA Repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 6(9), a016428–a016428. http://doi.org/10.1101/cshperspect.a016428