Fagi v boju proti patogenim bakterijam

Uvod

Pred nekaj več kot 100 leti sta Anglež Frederick Twort in Francoz Félix d'Hérelle neodvisno odkrila bakteriofage. D'Hérelle je opazil, da se fagi pojavljajo tam, kjer bakterije bujno rastejo. Poleg tega je opazil, da se pojavnost fagov v blatu pacientov poveča proti koncu bolezni. Predlagal je, da bi se dalo fage koristno uporabiti v zdravljenju bakterijskih okužb. Proti koncu dvajsetih in tridesetih let prejšnjega stoletja je bilo zdravljenje s fagi že komercialno dostopno. D'Hérelle je v tem času zelo uspešno zdravil bakterijske okužbe s fagi, medtem ko so drugi imeli precej slabe rezultate, najbrž iz slabega poznavajanja področja. Z razvojem antibiotikov je zanimanje za to področje zamrlo, razen v Sovjetski Zvezi. V Gruziji je George Eliava, ki je imel večkratne stike z D'Hérellom ustanovil zavod za raziskovanje fagov, ki je še danes delujoč. V času hladne vojne se je izmenjava znanja med zahodom in vzhodom prenehala. Danes se zahod spet vključuje v raziskovanje fagov, ker postaja odpornost bakterij na antibiotike čedalje večji problem. Njihova korist je precej očitna na področju medicini, uporabni pa bi bili tudi v kmetijstvu in živilski industriji. Zdravljenje s fagi se danes uporablja predvsem v Rusiji in Gruziji, v primeru ko antibiotiki ne zadostujejo. V Evropski uniji se zdravljenje s fagi uporablja le na Poljskem, kjer se za to specializira ena enota v Vroclavu.

Primerjava z antibiotiki

Bakteriofagi imajo kar nekaj prednosti v primerjavi z antibiotiki, a imajo tudi slabosti. Fagi, ki so uporabni za namene medicine, so načeloma baktericidni, za razliko od nekaterih antibiotikov, ki delujejo zgolj bakteriostatično in lahko s tem celo pospešijo širjenje odpornosti proti antibiotikom. Odmerek bakteriofagov v namene zdravljenja je enkraten in zelo majhen, ker se fagi lahko razmnožujejo. Obenem pa je to z vidika javnosti problematično, saj se načeloma to ne sliši zelo varno. Fagi so zelo specifični, torej lahko delujejo kvečjemu le na nekaj sevov bakterij iste vrste. To je prednosti in slabost – ne vplivajo na črevesno floro, hkrati pa je zato potrebno užiti t.i. fagni koktejl, to je mešanica več vrst bakteriofagov. Imajo zelo raznolike mehanizme delovanja, ki se razlikujejo tudi od mehanizmov delovanja antibiotikov, zato odpornost na antibiotik ne pomeni odpornosti na fag. Določeni eksperimenti nakazujejo, da imajo sposobnost prehajanja krvno-možganske bariere, torej v področje, kjer zdravljenje bakterijskih okužb z antibiotiki ni enostavno. Za razliko od antibiotikov, so fagi sposobni odstranjevati biofilme. Bakteriofage je relativno enostavno najti, ponavadi se jih izolira iz okolij, kjer živi veliko bakterij npr. iz odpadnih voda. Med zdravljenjem lahko pride do mutacij, ki zmanjšajo učinkovitost fagov. V današnjem času se zdi, da je zaupanje v zahodno medicino čedalje manjše, zato je s tega vidika prednost fagov tudi ta, da so naravni.

Delovanje bakteriofagov

Poznamo veliko število različnih bakteriofagov, do dandanes naj bi jih bilo znanih več kot 5500. Delijo se na 2 redova in na neuvrščene, ti pa se nadaljno delijo na skupno 18 družin. Kljub temu pa je njihova zgradba ne glede na različne vrste zelo podobna. Osnovno je nek fag na splošno zgrajen iz glave, ki nosi virusno DNA, vratu in več repov, ki služijo za prepoznavo receptorjev na površini bakterije. Sami po sebi so bakterijski zajedalci in imajo več različnih življenjskih ciklov. Med njih spadajo litičen, lizogen in psevdolizogen cikel ter kronične okužbe. Izmed teh ciklov je za temo našega seminarja še predvsem pomemben litičen cikel, saj je v medicinske namene pomembno, kako bakteriofag svoj tovor prenese v celico in jo s tem posledično ubije. Sam litičen cikel bakteriofaga se deli na več kritičnih korakov:

1. Prepoznavanje specifičnega receptorja na površini bakterije, in sicer za vsakega bakteriofaga obstaja določen receptor, ki ga prepozna, saj so sami lahko zelo specifični. Ponavadi so receptorji, ki jih prepozna fag, odvisni od same vrste bakterij, ni pa nujno, namreč prepoznajo lahko tudi več vrst bakterij. 2. Vnos fagne DNA v gostiteljsko celico, potem ko se razgradi bakterijska stena iz peptidoglikana s pomočjo fagne lizocimske aktivnosti, preko tako nastale pore. 3. Sprememba metabolizma gostitelja v podvajanje fagne DNA in sinteze fagnih proteinov. 4. Sestava in pakiranje fagnih delcev oziroma na splošno proizvodnja novih fagov znotraj celice bakterije. 5. Bakterijska celična liza in sprostitev hčerinskih fagov v okolico z namenom okužbe sosednjih celic.

Glede na to, da so bakteriofagi zelo specifični glede prepoznave receptorjev, so hkrati zelo dobra tarča za zdravila, saj bi tako le določen sev oziroma vrsto bakterij pobili, ne da bi pretirano ogrozili okoliških nepatogenih bakterij. Hkrati pa imajo tudi pomanjkljivosti, saj je potrebno najprej ugotoviti točno katera vrsta bakterija povzroča okužbo, saj če ne bo zdravilo določene vrste faga neuporabno.

Bakterijska odpornost proti bakteriofagom

Bakterijska odpornost proti bakteriofagom Prav tako kot proti antibiotikom, pa so bakterije razvile tudi odpornost proti fagom. In sicer lahko bakterija zavre fagni cikel na štiri načine:

1. Preprečitev vezave faga na specifične receptorje. 2. Preprečitev vstopa fagne DNA v celico z restrikcijskimi encimi in sistemom za preprečevanje prekomerne okužbe. 3. Razgradnja fagne DNA preko metode CRISPR in preko RM obrambnega sistema. 4. Blokiranje podvojevanje fagne DNA, transkripcije in translacije fagnih proteinov ter sestavljana samih virionov. To bakterija naredi preko prekinitvenih mehanizmov ali kar nesebičnega celičnega samomora.

Najpogostejša obramba izmed zgoraj naštetih je sicer preprečitev vezave fagov na površje celice, z zakrivanjem specifičnih receptorjev ali pa dovolj veliko spremembo strukture slednjih. Glede slednjih se pri različnih vrstah pojavijo različne tehnike, kako to naredijo.

Pristopi k reševanju pomanjkljivosti bakteriofagov pri zdravljenju bakterijskih okužb

Odpornost in specifičnost

Trenutno uveljavljena rešitev na tem področju so t.i. koktejli, kjer z uporabo 5-10 različnih bakteriofagov predpostavimo zadostno pokritost patogenih bakterij v naravi. Alternativa je izbor v danem primeru najbolj učinkovitega faga, za kar pa je potrebno izboljšati tehnologijo in protokole diagnostike, ter predpisovanja zdravil. Pripravki z več deset različnimi fagi lahko postanejo predragi in prezahtevni za proizvodnjo, zato je med pristopoma pomembno najti najboljše možno ravnovesje. Informacijo o vrsti gostiteljske bakterije pogosto nosi rep bakteriofaga. S pomočjo rekombinacije in usmerjenih mutacij so že večkrat uspešno spremenili njihov tarčni organizem brez vplivov na učinkovitost okužbe in razmnoževanja. Prenos gostiteljev so izvedli tako za znotraj vrste (npr. različni sevi E. coli), kot med vrstami (npr. med E. coli, ter Y. pestis in V. cholerae). Pri fagih, usmerjenih proti bakterijskim virulenčnim dejavnikom, je bila opažena povezava med pojavom odpornosti in upadom patogenosti, kar je pri klasičnih antibiotikih težje izzvati in združiti z drugimi prednostmi terapije.

Učinkovitost

S spreminjanjem bakteriofagov divjega tipa je raziskovalcem uspelo močno povečati njihovo učinkovitost, velikokrat merjeno kot logaritem padca števila bakterij. Med preizkušene pristope spadata na primer dodatek represorjev bakterijskih obrambnih in popravljalnih mehanizmov, ter vnos genov za občutljivost proti antibiotikom z lizogenimi fagi. Bolj učinkoviti so tudi fagi, opremljeni z depolimeraznimi encimi (ali geni zanje) proti bakterijskemu zunajceličnemu matriksu oz. biofilmu. Z dodatkom peptida, ki veže integrin (RGD) so uspešno omogočili vstop v celico fagu proti C. trachomatis (bakterija klamidije), ki je kot znotrajcelični parazit fagom sicer nedostopna.

Imunogenost

V mišjih modelih so pokazali, da je aktivnost bakteriofagov v telesu zmanjšana zaradi skupnega delovanja različnih elementov imunskega sistema. Z zaporednim vnosom fagov v krvni obtok so uspeli izolirati t.i. »dolgoživi« zvrsti faga λ z 13000- in 16000-krat povečano sposobnostjo izogibanja imunskemu odzivu. Razlika med (ne)imunogenimi zvrstmi je štela le nekaj aminokislinskih ostankov, kar kaže na relativno enostavno možnost modifikacije drugih uspešnih fagov. Več neodvisnih skupin je uspešno ustvarilo tudi fage, ki bakterijo onesposobijo hitro, a brez lize. To zmanjša količino sproščanja imunogenih proteinov in možnost burne reakcije. Tako kot ostale metode spreminjanja bakteriofagov, pa je komercialna uporaba odvisna od nadaljnjega razvoja učinkovitih tehnologij branja in spreminjanja virusnih genomov velikosti nekaj deset do sto kilobaznih parov.

Zaključek

Poleg že omenjenih imajo bakteriofagi še številne druge potencialne uporabe v diagnostiki, zaščiti hrane in celo v znanosti o materialih. Kljub temu, da razvoj znanosti na tem področju poteka hitro, ostajajo težave, ki so izven obsega ved o življenju. Trenutno je zakonodaja o zdravilih povsem nezdružljiva s spremenljivimi pripravki, ki jih zahteva od bolnikovih sevov odvisna terapija s fagi. Prav tako bo uporaba farmacevtskih pripravkov s potencialom za mutacije in razmnoževanje v povezavi s tehnologijami spreminjanja DNA verjetno srečala nemalo etičnih, pravnih in drugih pomislekov. Sodelovanje z družbo izven tradicionalne znanstvene stroke je torej ključno za uspešen prihod terapije z bakteriofagi.

Viri

Loc-Carrillo, C., in Abedon, S. (2011). Pros and cons of phage therapy. Bacteriophage, 1(2), 111–114. doi: 10.4161/bact.1.2.14590

Salmond, G. P. C., in Fineran, P. C. (2015). A century of the phage: past, present and future. Nature Reviews Microbiology, 13(12), 777–786. doi: 10.1038/nrmicro3564

Clokie, M. R., Millard, A. D., Letarov, A.V., Heaphy, S. (2011). Phages in nature. Bacteriophage, 1(1), 31-45. doi: 10.4161/bact.1.1.14942

Drulis-Kawa, Z., Majkowska-Skrobek, G., Maciejewska, B., Delattre, A.-S., Lavigne, R. (2012). Learning from bacteriophages - advantages and limitations of phage and phage-encoded protein applications. Current Protein & Peptide Science, 13(8), 699-722. doi: 10.2174/138920312804871193

Pires, D. P., Cleto, S., Sillankorva, S., Azeredo, J., Lu, T. K, Genetically Engineered Phages: a Review of Advances over the Last Decade. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 80(3), 523-543. doi: 10.1128/mmbr.00069-15

Labrue, S. J., Samson, J. E., Moineau, S., Bacteriophage resistance mechanisms. Nature Reviews Microbiology, 8(5), 317-27. doi: 10.1038/nrmicro2315

Levin, B. R., Bull, J. J., Population and evolutionary dynamics of phage therapy. Nature Reviews Microbiology, 2(2), 166-73. doi: 10.1038/nrmicro822

Ando, H., Lemire, S., Pires, D. P., Lu, T. K., Engineering Modular Viral Scaffolds for Targeted Bacterial Population Editing. Cell Systems, 1(3), 187-196. doi: 10.1016/j.cels.2015.08.013