Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje

Uvod

Dosedanje raziskave so pokazale, da bi bili bakteriofagi primerni za zdravljenje nekaterih bakterijskih okužb predvsem zaradi sposobnosti, da ubijejo bakterije in zdravijo okužbo, ne da bi pri tem poškodovali celice gostiteljskega organizma. Prav tako bi se z uporabo bakteriofagov do določene mere izognili težavam in tveganjem, ki jih povzročijo drugi načini zdravljenja (npr. antibiotiki). Kljub številnim prednostim so takšni načini zdravljenja bakterijskih okužb danes na voljo samo v nekaterih vzhodnoevropskih državah, saj obstajajo določena tveganja. Če bi tveganja uspeli zmanjšati, bi v prihodnosti lahko zdravljenje bakterijskih okužb z antibiotiki dopolnili z zdravljenjem z bakteriofagi, saj bi bila kombinirana terapija bolj učinkovita.

Težave pri izbiri ustreznega bakteriofaga

Bakteriofagi so zelo specifični, večina jih okuži le eno vrsto bakterij. Po pridobitvi bakteriofaga iz odpadnih vod ali preučevanega seva bakterij ga moramo identificirati in preveriti njegovo učinkovitost na izbrani sev. Bakteriofagni genom mora biti sekvencioniran, da se prepričamo, da ne vsebuje genov za rezistenco na antibiotike ali genov za toksine. Čeprav so danes metode sekvencioniranja zelo razširjene in zbirke identificiranih genov bakteriofagov obsežne, še vedno ostajajo geni, katerih funkcija ni raziskana, zato vsi bakteriofagi niso primerni za zdravljenje. Zaradi visoke specifičnosti se pojavijo težave pri izbiri primernega bakteriofaga za zdravljenje. Tudi če imamo na voljo koktajl bakteriofagov, moramo poznati bakterijo, ki povzroča okužbo. To pomeni, da moramo pacientu odvzeti vzorec in s pomočjo standardnih mikrobioloških postopkov določiti vrsto okužbe. Če ima pacient resno okužbo, nimamo časa za natančno diagnosticiranje seva bakterij, omejeni smo tudi finančno in z opremo laboratorijev. Prav tako vse bakterijske okužbe niso primerne za zdravljenje z bakteriofagi. Pri znotrajceličnih patogenih (npr. bakterije rodu Salmonella), ki so sposobni preživeti v notranjosti gostiteljevih celic, zdravljenje ne bi bilo uspešno, saj bakteriofagi ne morejo priti v notranjost evkariontskih celic.

V primeru široke uporabe bakteriofagov za zdravljenje bakterijskih okužb moramo upoštevati še vidik formulacije in stabilizacije bakteriofagov. Na njihovo stabilnost in aktivnost vplivajo temperatura, pH, ionska moč, pomemben je tudi mehanizem delovanja bakteriofaga. Pogoji stabilizacije in shranjevanja bakteriofagov morajo biti optimalni, določimo pa jih lahko le s kliničnimi preizkusi, ki so dolgotrajni in dragi, zato niso najbolj simpatični za farmacevtska podjetja. Analizirati moramo tudi način delovanja bakteriofaga, ki je odvisen od njegove adhezije na celico, časa, ki ga preživi v celici in rasti bakteriofagov, hkrati pa moramo vedeti, kako se naše telo odzove na njihovo prisotnost in v kolikšnem času začne naš imunski sistem bakteriofage inaktivirati. Vsi ti dejavniki so pomembni za pravilno določitev vrste in koncentracije bakteriofagov, ki jih bomo uporabili za zdravljenje.

Razvoj omnipotentnega oziroma širokospektralnega bakteriofaga s tehnologijo rekombinantne DNA je malo verjeten. Kljub temu ostaja nekaj upanja za razvoj bakteriofaga, ki bi uspešno prepoznal večino sevov nekega patogena. Bakteriofag, ki bi v genomu vseboval zapise za več hidrolaz, ki bi bile sposobne razgraditi različne površinske strukture na bakteriji, bi izkazoval širši antibakterijski spekter delovanja.

Bakterijska rezistenca

Bakterije lahko z različnimi mehanizmi onemogočijo bakteriofage na različnih točkah njihovega življenjskega cikla (za zdravljenje se večinoma uporabljajo bakterofagi z litičnim načinom replikacije), najpogosteje je preprečena adsorpcija na bakterijsko membrano. Bakterijska rezistenca na bakteriofage ne predstavlja tako velikega problema kot rezistenca na antibiotike, saj je veliko lažje najti drug bakteriofag kot razviti nov antibiotik. Zmanjšamo jo lahko z uporabo bakteriofagnih ‘koktajlov’ (mešanic različnih bakteriofagov), bakteriofagov v kombinaciji z antibiotiki ali s povišanjem koncentracije bakteriofagov.

Preprečevanje adsorpcije

Za uspešno okužbo bakterije se mora bakteriofag vezati na receptorje na njeni membrani. Bakterije lahko preprečijo adsorpcijo tako, da spremenijo te receptorje, jih skrijejo, sintetizirajo dodatne komponente zunajceličnega matriksa ali kompetitivne inhibitorje, ki se vežejo na receptorje in preprečijo dostop bakteriofagom. Lahko pa bakterije modificirajo komponente na membrani, ki služijo za njihovo prepoznavanje (npr. lipopolisaharidi, proteini, kapsule, bički ...).

Preprečevanje vstopa bakteriofagne DNA v bakterijo

Nekateri fagi (oz. profagi) v svojem genomu vsebujejo zapis za posebne membranske ali na membrano vezane proteine, sisteme Sie (Superinfection Exclusion), ki preprečijo vnos DNA določenim drugim fagom. Opaženi so bili večinoma pri gramnegativnih bakterijah. Kolifag T4 na primer vsebuje zapis za proteina Imm in Sp, prvi spremeni konformacijo mesta injiciranja, drugi pa inhibira encim lizocim (razgrajuje bakterijsko celično steno).

Razgradnja bakteriofagne DNA

Bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme predstavljajo proteini, ki jih ščitijo pred tujo DNA. Ko nemetilirana bakteriofagna DNA vstopi v celico, jo restrikcijski encimi večinoma razgradijo, lahko pa se zgodi tudi, da jo metilirajo encimi metilaze, s čimer postane zaščitena pred restriktazami in fag vstopi v litični cikel. Bakteriofagi so tudi razvili mehanizme, s katerimi preprečijo delovanje restriktaz (npr. odstranitev prepoznanih mest za endonukleaze iz genoma).

CRISPR-Cas

Pri nekaterih arhejah in bakterijskih sevih so odkrili imunski sistem CRISPR-Cas, ki pomaga pri obrambi pred fagi in plazmidi. Sestavljajo ga gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev ali CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) in s ponovitvami povezana zaporedja ali Cas (CRISPR Associated Sequences). CRISPR so sestavljeni iz več zaporednih vmesnikov in ponovitev, pred njimi na DNA pa je zapis za proteine Cas. Ko fagi sprostijo DNA v bakterijo, jo proteini Cas razgradijo na krajše segmente, ki jih dodajo v bakterijski genom večinoma na 5’-konec CRISPR kot nov vmesnik. Po transkripciji nastane crRNA (CRISPR RNA), ki skupaj s proteini Cas tvori crRNP (ribonukleoprotein CRISPR). Ko virus ponovno okuži bakterijo, crRNP prepozna in razgradi zaporedje komplementarno crRNA. Bakterije si torej zapomnijo fagno DNA in z njeno razgradnjo preprečijo okužbo.

Abortivna infekcija

Obrambni mehanizmi imajo lahko za bakterije tudi negativne posledice. Bakterije, ki preprečijo replikacijo, transkripcijo ali translacijo s pomočjo mehanizmov abortivne infekcije lahko umrejo, pri čemer fag ostane ujet znotraj celice. Tako preprečijo okužbo ostalih bakterij.

Rezistenca na antibiotike in horizontalni prenos genov

Fagi, za katere je značilen lizogeni cikel, lahko vključijo svojo DNA v gostiteljsko. Nekateri fagi vsebujejo gene za odportnost proti antibiotikom, ki se lahko s horizontalnim prenosom genov (ang. horizontal gene transfer) prenesejo na bakterije. Na tak način se lahko prenesejo tudi geni, ki pripomorejo k virulenci bakterij. Fagi pa lahko od bakterij prevzamejo zapis za gene, ki omogočajo sintezo toksinov. Prenos genov lahko preprečimo z uporabo bakteriofagov, ki niso sposobni prevzeti DNA ali pa namesto bakteriofagov uporabimo samo njihove encime. Lahko pa vključimo v fagni genom smrtonosne gene ali gene, zaradi katerih postanejo bakterije dovzetne za antibiotike.

Sprostitev celičnih komponent iz liziranih celic

V končnem koraku cikla bakteriofagov pride do lize bakterijskih celic in sprostitev novih fagov v okolico. Vendar se pri razgradnji bakterijske celice v okolico sprostijo tudi njene celične komponente. To predstavlja težavo v procesu zdravljena z bakteriofagi, saj le-ti v kratkem času lizirajo večje količine celic, njihove celične komponente pa vplivajo na okoliška tkiva.

Zunanja membrana gramnegativnih bakterij vsebuje lipopolisaharide, ki so potencialni sprožilci vnetnega odziva. Višja je raven bakterijskih endotoksinov, hujši je septični šok. Ker so bakteriofagi zelo učinkoviti in hitri, se v kratkem času sprostijo večje količine bakterijskih endotoksinov, kar lahko vodi do vročine in septičnega šoka. Fizična poškodba bakterijske stene poteka tudi pri antibiotikih, vendar se toksini sproščajo počasneje, v daljšem časovnem obdobju.

Bakteriofagi se ob koncu cikla sprostijo iz gostiteljske celice s pomočjo holin-lizinskega sistema (dsDNA bakteriofagi) ali z inhibicijo sinteze peptidoglikanov (z amurini, majhni bakteriofagi RNA/DNA). Holini so majhni membranski proteini, ki se sidrajo v plazmalemo bakterije in ob točno določenem času vplivajo na membranski potencial in plazmalema postane permeabilna za endolizin, kar omogoči dostop endolizina do mureinskega sloja. Endolizini so peptidoglikanske hidrolaze, ki razgradijo bakterijsko celično steno, kar vodi do lize celice. To omogoči sprostitev bakteriofagov in bakterijskih komponent iz bakterijskih celic. Možna rešitev za to težavo so rekombinantni bakteriofagi, ki ne vsebujejo gena za encim endolizin, ali bakteriofagi z okvarjenim litičnim sistemom.

Neželen odziv imunskega sistema

Neželen odziv imunskega sistema pri zdravljenju z bakteriofagi bi poleg bakteriofagov povzročile tudi druge komponente, potencialno prisotne v zdravilu. Koktajl bakteriofagov ni enostaven za pripravo, saj je bakteriofage zelo težko natančno izolirati od bakterij, kjer smo jih gojili. Če bi bile v zdravilu poleg bakteriofagov prisotne še bakterije (ki so pravzaprav povzročiteljice okužbe) oziroma toksini teh liziranih bakterij, bi to lahko povzročilo še večjo okužbo oziroma sepso.

Neželen odziv imunskega sistema lahko povzročijo tudi bakteriofagi. Nekateri so dokazano imunogeni in izzovejo tvorbo protiteles. Pri preučevanju odziva imunskega sistema je ključna kinetika. Pri prvem zdravljenju je bakterijska liza veliko hitrejša kot počasen primarni imunski odziv, ki zato ne bi predstavljal večjega tveganja. Pri naslednjem zdravljenju z enakim bakteriofagom bi imunski sistem odreagiral prej kot bi bakteriofag pozdravil okužbo, ker bi prišlo do hitrejšega spominskega (sekundarnega) imunskega odziva. Limfociti B bi lahko hitreje izdelali protitelesa. Sodeloval bi humoralni imunski odziv, ki je posledica antigenov, ki se nahajajo v telesnih tekočinah. Imunski sistem pa bi poleg preprečevanja učinkovitega zdravljenja imel tudi druge negativne učinke. Mednje spada vnetni odziv, ki lahko povzroči poškodbe tkiva in vključuje povečanje količine različnih vnetnih citokinov, med katerimi so tudi interlevkini, dejavniki tumorske nekroze α, interferoni γ, granulocitno-makrofagne kolonije stimulirajoči faktorji in reaktivne kisikove spojine.

Raziskovalci so za rešitev problema razvili metodo za izolacijo bakteriofagov, ki jih imunski sistem ne prepozna. Enterofag l iz miši so pomnožili in vitro v kulturah mutatorske bakterije E. coli in jih ponovni injicirali. Po desetih krogih takšne selekcije so izolirali bakteriofag, na katerega se mišji imunski sistem ni odzival in je bil zato uspešnejši pri odpravljanju ponovnih okužb. Rezultat pojasnjuje mutacija antigenskih determinant na bakteriofagni ovojnici.

Na imunski sistem pa zanimivo vpliva tudi interakcija bakteriofaga Pf, ki okuži bakterijo Pseudomonas aeruginosa, s človeškimi celicami. Bakteriofagni proteini interagirajo s toličnimi receptorji v makrofagih, ki preko adapterjev TRIF in preko interferona tipa 1 inhibirajo sintezo citokinov TNF na ravni transkripcije, kar zmanjša fagocitozo bakterij. Tako bakteriofag sodeluje z bakterijo, da ta lažje okuži rano. Čeprav bi z bakteriofagi bakterije lizirali, bi fagi po drugi strani lahko oslabili odziv imunskega sistema in upočasnili fagocitozo bakterij.

Negativne posledice za okolje

Čeprav so fagi naravno prisotni v okolju (v prsti, na mililiter rečne vode je okoli 2×10⁸ fagov, najdemo pa jih tudi v organizmih), bi bila koncentracija fagov, uporabljena za zdravljenje, višja kot koncentracija kateregakoli faga v naravi. V primerjavi z antibiotiki batkeriofagi ne razpadejo tako hitro, saj so stabilni v širokem temperaturnem intervalu. Prav tako se po zdravljenju delijo naprej, če je v okolju prisotna gostiteljska bakterija. To bi ustvarilo neravnovesje v ekosistemu, saj bi večja koncentracija bakteriofagov neposredno vplivala na število gostiteljskih bakterij. Če so te bakterije simbiotsko ali kako drugače povezane z ostalimi organizmi, bi bakteriofagi posredno vplivali tudi na druge organizme v ekosistemu. Tako bi lahko v človeškem organizmu prišlo do disbioze, to pa je neravnovesje med različnimi vrstami bakterij v različnih delih telesa (koža, črevesje, vagina), kar bi povzročilo zdravstvene probleme kot sta driska in napenjanje. V okolju bi disbioza vplivala na kroženje hranil. V prsti je razmerje med fagi in bakterijami 1:1, v morskem okolju pa 1:100, porušenje tega razmerja bi vodilo do spremenjene distribucije hranil. Tveganje za okolje je visoko tudi zato, ker trenutno ne poznamo nobenih primernih metod, s katerimi bi lahko fage učinkovito odstranili iz okolja.

Viri in literatura

Principi, N, Silvestri, E. in Esposito, S. Advantages and Limitations of Bacteriophages for the Treatment of Bacterial Infections. Frontiers in Pharmacology. 2019, 10, str. 513.

Doss, J., Culbertson, K., Hahn, D., Comacho, J. in Barekzi, N. A Review of Phage Therapy against Bacterial Pathogens of Aquatic and Terrestrial Organisms. Viruses. 2017, 9(3), str. 50.

Drulis-Kawa, Z., Majkowska-Skrobek, G., Maciejewska, B., Delattre, A. S. in Lavigne, R. Larning from Bacteriophages - Advantages and Limitations of Phage and Phage-Encoded Protein Applications. Current Protein&Peptide Science. 2012, 13(8), str. 699-722.

Labrie, S. J., Samson, J. E. in Moineau, S. Bacteriophage resistance mechanisms. Nature Reviews Microbiology. 2010, 8(5), str. 317-327.

Meaden, S. in Koskella, B. Exploring the risks of phage application in the environment. Frontiers in Microbiology. 2013, 4, str. 358.