Natančnost replikacije koronavirusne RNA

Uvod

Bistvo vsakega virusa, katerega lahko uvrstimo med parazitske organizme, je da si najde ustrezen gostiteljski organizem, kjer se bo lahko uspešno razmnoževal in širil naprej. Takšni virusi so zagotovo tudi koronavirusi, ki so veliki RNA virusi z ovojnico in spadajo v večjo naddružino imenovano Nidovirales. Pri ljudeh povzročajo številne bolezni, kot so akutni respiratorni sindrom (SARS) in druge okužbe dihal in prebavil. Koronavirusi zapisujejo v svojem genomu 16 nestrukturnih proteinov. Odkrili so, da nestrukturni protein 14 (nsp14) koronavirusov vsebuje oziroma zapisuje 3'- 5' eksoribonukelanzo aktivnost ali ExoN na kratko. ExoN akivnost je encimska aktivnost, ki vpliva na razgradnjo RNA tako, da poteče cepitev na 3' koncu. Pri tem se odcepijo posamezni nukleotidi.

Značilnosti koronavirusne RNA

Struktura koronavirusnega genoma je za vse predstavnike te družine podobna, gre za viruse z pozitivno usmerjeno enoverižno RNA, katera je nesegmentirana in dolga 27-32 kb. Če govorimo specifično o strukturi SARS-CoV-2 je sestavljena iz gena 1, ki kodira vse proteine pomembne za replikacijo in transkripcijo. Geni 2-9 pa zapisujejo strukturne in pomožne proteine, ki se prepisujejo ločeno iz subgenomskih mRNA (sgRNA).

RNA virusi zaradi visoke stopnje napak pri razmnoževanju obstajajo kot »kvazivrste«, ki jih opredeljujemo kot »vrste sorodnih genotipov«. Dokazano je, da prihaja tekom evolucije večkrat do mutacij v kvazivrstah kot v primarnih oziroma originalnih genomih, zato je tako zelo različnih patogenih učinkov.

Podvojevanje, prepisovanje in prevajanje koronavirusne RNA

Konceptualno ločimo dva dela sinteze koronavirusne RNA: replikacija (prepisovanje) genoma in subgenomska RNA transkripcija (podvojevanje). Pri genomski replikaciji je pozitivno usmerjena RNA veriga prepisana v negativno usmerjeno RNA verigo, saj se na ta način doseže večje število na novo podvojenih pozitivnih verig iz predhodno nastale negativne verige. Posebnost koronavirusov je, da lahko poleg na novo sintetiziranega genoma ustvarijo tudi nekakšen 3' ugnezden niz subgenomskih mRNA iz katerih se potem sintetizirajo strukturni in pomožni proteini. Vsaka subgenomska mRNA vebuje približno 70 začetnih nukletotidov , ki so del 5' vodilnega zaporedja.

TRS

Med transkripcijo, ko se prepisuje negativno usmerjena veriga, virusna RdRp prepozna za virus specifična ohranjena zaporedja, ki se imenujejo transkripcijska regulatorna zaporedja ali TRS, ta se nahajajo navzgor od vsakega odprtega bralnega okvirja subgenomske mRNA. Na tej točki polimeraza bodisi prebere skozi do naslednjega TRS-ja ali pa bodisi disociira iz predloge verige in se nato ponovno poveže z vodilnim TRS ( ta se nahaja v 5'UTR) in zaključi sintezo subgenomske RNA negativne verige, ki vsebujejo antileader RNA (po velikosti ekvivalentne vsaki virusni mRNA). Te subgenomske negativne verižne RNA nato delujejo kot glavne predloge za proizvodnjo subgenomskih mRNA, ki so 3'-koterminalne in imajo vse vodilno zaporedje iz približno 70 začetnih nukleotidov iz 5' vodilnega zaporedja. Zaradi tega transkripcijskega mehanizma lahko spremembe v zaporedjih TRS tudi vplivajo na učinkovitost replikacije virusa.

RdRp

Od RNA odvisna RNA polimeraza ali RdRp, ki jo zapisuje nestrukturni protein12, predstavlja centralno komponento replikacijsko-transkripcijskega kompleksa ali RTC. Ta je primarno odgovoren za podvojevanje virusne RNA. Njegova druga naloga pa je prepisovanje subgenomskih mRNA, katere zapisujejo strukturne in podporne proteine. Nsp12 ne deluje samostojno ampak potrebuje še zraven nsp7 in nsp8, ki delujeta kot kofaktorja. Strukturo trimernega kompleksa (nsp12-nsp7-nsp8) so določili s pomočjo krioelektroskopske mikroskopije. Če se osredotočimo na nsp12 SARS-Cov2. Zabeleženo je bilo, da ima RdRp domeno, ki je podobna strukturi nekakšne »desne roke«, kar je značilno za polimeraze. Poleg tega motiva je bil v strukturi prisoten tudi nekakšen podaljšek na N-končni domeni, ki pa je značilnost za Nidoviruse z nukleotidiltransferazno aktivnostjo.

Nsp14-ExoN

Koronavirusni nestrukturni protein 14 (nsp14) je večnamenski protein z aktivnostmi eksoribonukleaze in metiltransferaze. Bioinformatična napoved domnevne eksoribonukleaze (ExoN), kodirane v replikaznem nsp14 vseh koronavirusov, je privedla do ugibanj, da ExoN deluje pri lektoriranju med razmnoževanjem. Ta pridobljen ExoN s predhodnim virusom je ključnega pomena za širitev in vzdrževanje velikega števila koronavirusnih genomov. Amino-terminalna polovica (59-kDa) nsp14 vključuje 3′-do-5′ ExoN motive I (DE), II (D) in III (D), ki so bili prvotno identificirani v celičnih encimih superdružine DEDD, vključno s tistimi, ki katalizirajo lektoriranje DNA. Dokazano je, da ima bakterijsko izraženi SARS-CoV nestrukturni protein 14 3'- do 5' ExoN aktivnost in vitro. Alaninska substitucija ostankov DE-DD pa močno poslabša ali odpravi to dejavnost. Znotrajcelična RNA cilja na dejavnost ExoN-a, verjetno pa vključuje tudi vmesne virusne RNA. Pomembno je omeniti, da lahko vključuje tudi celične mRNA, nekodirajoče RNA in/ali mikroRNA, ki kodirajo ali uravnavajo kritične protivirusne aktivnosti med okužbo. Karboksi-terminalna polovica nsp14 ima tudi metiltransferazno aktivnost (kodira novo funkcijo N7-metiltransferaze) ter neodvisne funkcije pri sintezi RNA in virulence pri živalih.

Nsp14-ExoN je potreben za natančnost replikacije

V laboratorijskih raziskavah z mišjim virusom hepatitisa MHV (M-ExoN) in SARS-CoV (S-ExoN) so zamenjali alanin pri DE motivu I kar je omogočilo obnovitev mutantov s skromnimi replikacijskimi napakami v primerjavi z divjimi oblikami teh virusov. To je pokazalo, da funkcionalna ExoN aktivnost ni nujno potrebna za replikacijo v kulturi. Sekvenciranje je pokazalo 12- do 20-kratno povečanje frekvence mutacije in do 14-kratno povečanje hitrosti mutacije kot primerljivo izolirani in zaporedni divji tip MHV ali SARS-CoV. M-ExoN in S -ExoN imata podobne mutatorske fenotipe na visoki ravni, od 5 do 20-krat večje od tistih, ki so jih opazili pri drugih virusih RNA pri istih pogojih.

M-ExoN ima ocenjeno stopnjo mutacije, podobno kot drugi znani virusi RNK divjega tipa, medtem ko ima divji tip MHV v resnici 15-krat manjšo stopnjo mutacije kot drugi virusi RNK, kar kaže na to, da ExoN podvaja replikacijo genoma CoV v zelo visoki meri. Ta rezultat je bil v skladu s predvidevanji, da bo za stabilnost velikih genov RNA morda potreben ExoN. Da bi preverili, ali bi te ugotovitve lahko uporabili v različnih koronavirusih, so bile študije opravljene tudi s S-ExoN. Rezultati so pokazali 21-kratno povečanje frekvence mutacije in 14-kratno povečanje hitrosti mutacije med genomi S-ExoN v primerjavi z maso SARS-CoV. Tako za S-ExoN kot za M-ExoN so bile mutacije porazdeljene po genomih brez statistične pristranskosti za regije genoma, za vrsto mutacije (položaj kodona, transverzija, prehod) ali za sinonimne, nesinonimne ali nekodirajoče mutacije. Analiza je bila izvedena le na populacijah, ki so sposobne za replikacijo in je zato izključila smrtonosne ali globoko škodljive posamezne ali kombinirane mutacije. Tako rezultati verjetno predstavljajo zelo malo število vseh možnih mutacij, ki bi jih zaznali pri analizi celotnih virusnih genov.

ExoN: Stroj za lektoriranje RNA?

Vse raziskave trdijo k dejstvu, da nsp14-ExoN neposredno posreduje ali sodeluje pri preprečevanju ali popravljanju mutacij. Mogoče je, da je vključitev nsp14-ExoN v koronaviruse omogočila razširitev genoma in je bila potem potrebna za vzdrževanje velikega in kompleksnega genoma.

V tem primeru ostaja osrednje neodgovorjeno raziskovalno vprašanje: s kakšnim mehanizmom nsp14 povečuje zvestobo replikacije? Obstaja več možnih modelov, vsak se lahko pojavi sam ali v kombinaciji kot funkcije nsp14 ali z drugimi replikaznimi proteini.

(1) Nsp14 ExoN lahko neposredno posreduje lektoriranje RNA. To bi bilo analogno lektoriranju DNA, kadar eksonukleazno aktivnost pogosto zagotavlja podenota, ki se razlikuje od aktivnosti polimeraze. V zvezi s tem je opazno, da tudi eksonukleaze za lektoriranje DNK spadajo v naddružino DE-D-D.

(2) Nsp14 bi lahko spodbudil lastno domnevno 3'-do-5 'ExoN aktivnost RdRp. To bi bilo podobno lektoriranju RNA med celično transkripcijo z evkariontsko RNA pol II in bakterijskim RNAP.

(3) Nsp14 bi lahko povečalo zvestobo RdRp z alosteričnim učinkom, ki bi preko RdRp prenašal konformacijske spremembe. Čeprav precedenčni primer v lektoriranju DNA ali RNA ni očiten, obstajajo številni primeri alostrije kofaktor-encim.

(4) Nsp14-ExoN bi lahko sodeloval pri popravilu z rekombinacijo RNA. Glede na to, da je visokofrekvenčna homologna rekombinacija v obliki diskontinuirane transkripcije osrednjega pomena za izražanje genov za nidovirus in da so mutanti ExoN človeškega CoV-229E spremenili podgenomska razmerja mRNA in motnje gibljivosti, je smiselno predlagati, da se subgenomska transkripcija in rekombinacija morda razvila pri koronavirusih in da je nestrukturni protein 14- ExoN ključen pri tem procesu.

Najverjetnejši model je, da nsp14 sodeluje z drugimi encimi koronavirusa in s tem tvori kompleks, ki sodeluje pri prepoznavanju in popravljanju napak. Čeprav je bilo doslej samo nsp14 dokazano, da hidrolizira nukleotide le na 3' koncu RNA, bi zaporedno delovanje nsp15-EndoU in nsp14-ExoN teoretično omogočilo odstranitev notranjih, neusklajenih nukleotidov. Torej, medtem ko lahko nsp14 olajša korekcijo ostankov le na naraščajočem koncu rajajoče se verige RNA, bi lahko medsebojna interakcija nsp15 in nsp14 olajšala korekcijo ostankov na drugih mestih in verjetno v molekulah polne dolžine, ki ne nastajajo več. Končno, koronavirusi šifrirajo metiltransferazo (nsp16), ki posebej sodeluje z nsp14 za metilacijo kapice in bi lahko sodelovala tudi pri zvestobi ali drugih modifikacijah RNA katere omogočajo širitev genoma koronavirusa.

Viri in literatura

• M. R. Denison, R. L. Graham, E. F.Donaldson, L. D. Eckerle, E. S. Baric: Coronaviruses: An RNA proofreading machine regulates replication fidelity and diversity. RNA Biology. 2011. 2. str. 270-279.
• E. Wit, N. Doremalen, D. Falzarano, V. J. Munster: SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 2016. 14. str. 523-534.
• E. Minskaia, T. Hertzig, A. E. Gorbalenya, V. Campanacci, C. Cambillau, B. Canard, J. Ziebuhr: Discovery of an RNA virus 3'-5' exoribonuclease that is critically involved in coronavirus RNA synthesis. National Academy of Sciences. 2006. vol. 103, no. 13, str. 5108-5113.
• Y. Gao, L. Yan, Y. Huang, F. Liu, Y. Zhao, L. Cao, T. Wang in sodelavci. Structure of the RNA-dependent RNA polymerase from COVID-19 virus. Science 10.1126/science.abb7498 (2020)